蛋白质分子量测定

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1、蛋白质分子量测定的方法凝胶过滤法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法沉降法（超速离心法）凝胶过滤层析应用a.分离蛋白质b.脱盐c.蛋白质分子量的测定原理凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。由于不同排阻范围的葡聚糖凝胶有一特定的蛋白质分子量范围，在此范围内，分子量的对数和洗脱体积之间成线性关系。因此，用几种已知分子量的蛋白质为标准，进行凝胶层析，以每种蛋白质的洗脱体积对它们的分子量的对数作图，绘制出标准洗脱曲线。未知蛋白质在同样的条件下进行凝胶层析，

2、根据其所用的洗脱体积，从标准洗脱曲线上可求出此未知蛋白质对应的分子量。内水体积Vi外水体积Vo柱床体积Vt洗脱体积VeVt=Vo+Vi+VgVe=Vo+KdViKd=(Ve-Vo)/Vi优点：a.条件温和b.操作简便c.损失少回收率高d.层析柱可反复使用凝胶的类型：Sephadex:交联葡聚糖Sepharose：琼脂糖凝胶Bio-GelABio-GelP：聚丙烯酰胺凝胶分子筛Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150G-200吸水量（g/g干

3、凝胶）1.01.52.55.07.510.015.020.0工作范围（肽与蛋白）D<700<1500<50001500-200003000-700004000-1500005000-3000005000-500000器材：层析柱、部分收集器、核酸蛋白质检测仪、记录仪凝胶及柱的选择返回凝胶的处理及装柱凝胶干粉的溶胀（热溶胀）、浮选、抽气、装柱、蓝色葡聚糖检查、平衡装柱时要注意操作压。装柱的两种方法：a.手工操作1/3床体积水→加入少许凝胶积起1-2厘米凝胶床→打开出水口→连续缓慢加入凝胶b.电动搅拌下的装柱法（如图4-9

4、）样品上柱分析用量：柱床体积的1—2%制备用量：柱床体积的20—30%洗脱收集部分收集器、核酸蛋白检测仪凝胶的保存方法0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰装柱示意图返回核酸蛋白检测仪及记录仪（正面）核酸蛋白检测仪及记录仪（背面）返回核酸蛋白检测仪返回记录仪返回部分收集器部分收集器返回返回Kd=0Kd=101SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量PolyacrylamideGelElectrophoresis，PAGE实验原理SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法

5、，。1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），SDS是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对

6、电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。3.当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程：1gMr=K―bmR式中：Mr为蛋白质的分子量；K为常数；b为斜率；mR为相对迁移率。在条件一定时，b和K均为常数。若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。一、PAG的组成PAG是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr）单体和N，N’-亚甲双丙烯酰胺（N，N，N’，N’

7、-methylenebixacrylamide，Bis）交联剂通过自由基聚合而成的一种多孔三维网状结构。Acr+Bis-----多孔三维网状结构（1）丙烯酰胺结构式（2）亚甲双丙烯酰胺二、PAG的聚合需要催化剂——氧化还原系统作用，使Acr单体带有游离基，从而与Bis进行聚合。（一）化学聚合：AP-TEMED系统过硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammoniumpersulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。AP在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯

8、酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶。TEMED的游离碱基能促进AP的形成SO42-。注意：TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件下聚合分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合（二）光聚合：核黄素-TEMED系统核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外