蛋白 SDS-PAGE纯度鉴定与分子量测定

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1、蛋白SDS-PAGE纯度鉴定与分子量测定一、原理：（1）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）简称SDS-PAGE。用于蛋白纯度及蛋白质亚基相对分子量（relativemolecularmass,Mr）测定。SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。SD

2、S破坏蛋白质氢键、疏水键，引起蛋白质构象改变，使蛋白质－SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。因此，蛋白质—SDS复合物(SDS-denaturedprotein)在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bXMW：分子量；X：迁移率；k、b均为常数将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率即可

3、在标准曲线上求得分子量。（2）分离效应：PAGE根据其有无浓缩效应，分为：连续电泳（continuouselectrophoresis）：采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳（discontinuouselectrophoresis）：采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系连续PAGE：电荷效应；分子筛效应不连续PAGE：电荷效应；分子筛效应；浓缩效应不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。①浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然

4、后再进入分离胶进行分离。②电荷效应：分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。③分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。SDS-PAGE线性分离范围丙烯酰胺浓度（%）线性分离范围（kD）1512—431016—687.536—94557—212二、实验材料和试剂 器材：（1）夹心式垂直板电泳槽，凝胶模（135×100×1.5mm）（北京六一仪器厂）（2）直流稳压电源（电压300-600V，电流50-100mA）（3）吸量管（1、5、10ml）；（4）烧杯（

5、25、50、100ml）；（5）细长头的滴管（6）1ml注射器及6号长针头；（7）微量注射器（10μl或50μl）     试剂：标准蛋白质：不连续体系SDS-PAGE有关试剂（1）10%（W/V）SDS溶液：称5gSDS，加重蒸水至50ml，微热使其溶解，置试剂瓶中，4℃贮存。SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。（2）1%TEMED（V/V）：取1mlTEMED，加重蒸水至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。（3）10%AP（W/V）：称AP1g，加重蒸水至10ml。最好临用前配制。（4）样品溶解液：内

6、含1%SDS，1%巯基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol/LpH8.0 Tris-HCl缓冲液。①先配制0.05mol/LpH8.0 Tris-HCl缓冲液：称Tris 0.6g，加入50ml重蒸水，再加入约3ml 1mol/LHCl，调pH至8.0，最后用重蒸水定容至100ml。②按下表配制样品溶解液：表：不连续体系样品溶解液配制*如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体积混合。SDS巯基乙醇溴酚蓝蔗糖0.05mol/LTris-HCl加重蒸水至最后总体积为100mg0.1ml

7、2mg4g2ml10ml（5）凝胶贮液①30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称Acr 30g及Bis 0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃贮存。②10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃贮存。（6）凝胶缓冲液①分离胶缓冲液（3.0mol/LpH8.9 Tris-HCl缓冲液）：称Tris 36.3g，加少许重蒸水使其溶解，再加1mol/L HCl约48ml，调pH至8.9，最后加重蒸水定容至100m

8、l，4℃贮存。②浓缩胶缓冲液（0.5mol/L pH6.7 Tris-HCl缓冲液）：称Tris6.0g，加少许重蒸水使其溶解，再加1mol/L HCl约48ml调pH至6.7。最后用重蒸水定容至100ml，4℃贮存。（7）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/L Tris-0.384 mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸