实验九、十 酶联免疫吸附试验.ppt

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1、实验九酶联免疫吸附试验-ELISA实验十IgG的分离和纯化程燕2014年6月9日实验九酶联免疫吸附试（Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）实验目的1.掌握酶联免疫吸附试验的原理、种类和用途。2.学习用酶联免疫吸附试验双抗体夹心法检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的方法。3.了解HBsAg阳性的意义。实验原理用酶来标记抗原或抗体的免疫分析分析技术。由于酶的高效生物催化作用，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法

2、。实验原理将已知抗体（或抗原）结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。测定时将待检标本和酶标抗体（或酶标抗原）按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体（或抗原）发生反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离物成分，然后加入底物显色，进行定性或定量测定。实验原理ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性（疏水性）地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判

3、定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。实验原理常用酶联免疫吸附试验有间接法竞争法双抗体夹心法ELISA-间接法此法是检测抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体上，加入待测血清(抗体)与之结合，洗涤后，加酶标抗体和底物进行测定。其原理见图。酶标抗体固相抗原待测抗体EEEELISA间接法示意图底物用于抗原及半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，将特异性抗体吸附于固相载体上，加入待测抗原和一定量的已知酶标抗原，使二者竞

4、争地与固相抗体结合，经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。固相抗体EEE酶标抗原待测抗原E底物E显色反应（弱）固相抗体EEE酶标抗原底物显色反应（强）EEEEEEELISA-竞争法ELISA-双抗体夹心法双抗体夹心法常用于检测抗原。将已知抗体吸附于固相载体，加入待测标本(含相应抗原)与之结合，温育后洗涤，加入酶标抗体及底物溶液进行测定。酶标抗体固相抗体待测抗原EEE双抗体夹心法检测抗原实验材料1、乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒定性检测人血清或血浆中的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg。包括：H

5、BsAg特异性抗体（一抗）已包被于酶标板上HBsAg阴、阳性血清各1份、酶标抗体（二抗）1份，显色剂A、B各1份，终止液1份，洗涤液1份，2、待检血清5份3、微量加样器（10-100ul）及匹配的枪头4、废液缸注意：有污染性。夹心法检测HBsAg方法由于抗体1已包被在酶标板上，故直接从加抗原开始。1、加样：每组2条8孔，待检8孔，阴性对照、阳性对照、空白对照各1孔。分别加75ul待测样本和阴、阳性对照于相应孔内，盖封板膜，置37℃恒温箱温育60分钟。2、加酶标抗体：除空白对照孔外，每孔加1滴酶标溶液，混匀后封板，

6、置37℃水浴箱温育30分钟。3、洗涤：用洗涤液（按说明配制）注满各孔，静置20秒，甩去洗涤液，重复4次，最后一次在吸水纸上拍干。4、显色：每孔加底物液A、B各1滴（50ul），轻拍混匀，置37℃避光显色30分钟，肉眼观察。5、终止：每孔加终止液1滴（50ul），轻拍混匀。在10分钟内酶标6、测定：用酶标仪（波长450nm）测定各孔吸光度OD值。酶：辣根过氧化物酶(HRP)底物：3,3‘,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）在辣根过氧化物酶催化下，TMB会产生可溶性蓝色产物。使用2M H2SO4终止反应，在450nm测

7、定吸光度。结果判断1、定性：夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。2、P/N值≥2.1者判为HBsAg阳性；P/N值＜2.1者判为阴性。介于中间为可疑。S：待测样本OD值COV：cut-offvalue=NCx+0.100NCx：阴性对照OD值的均值阳性判定值=S/COV≧1.0：阳性﹤1.0：阴性实验报告1、计算5个待测样本的S/COV，判断结果2、本实验中采用的酶、底物及反应原理。实验十IgG的分离和纯化实验目的实践IgG分离纯化过程了解分离、纯化抗体的原理比较成年牛血清与新生牛血清中IgG的含量（眼观）

8、实验原理利用蛋白质盐析原理，分离血清中的IgG:不同蛋白质在同一浓度盐溶液中的溶解度不同，因此，可利用不同浓度的盐溶液使血清中的各个蛋白质成分分别析出。血清蛋白质：复杂混合物。1、白蛋白、a1、a2、β球蛋白，纤维蛋白原，凝血酶原和其它凝血因子等均由肝细胞合成。2、γ球蛋白主要来自浆细胞。免疫球蛋白大多数存在于丙种球蛋白（γ-球蛋白）中。免疫球蛋白可以分为IgG、IgA、