巨噬细胞功能检测.doc

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1、单核－巨噬细胞吞噬功能测定单核－巨噬细胞在机体免疫反应中起着重要作用，因此，检测单核－巨噬细胞功能对于了解机体的免疫功能状态具有重要意义。小鼠巨噬细胞吞噬功能试验（体外法）1、原理巨噬细胞具有吞噬异物的功能，将巨噬细胞与被吞噬物(鸡红细胞、白色念珠菌、白色葡萄球菌等)共同温育，染色，在油镜下计数吞噬异物的巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数，以此判断巨噬细胞的吞噬功能，从而评价机体的免疫状态。2、方法(1)．小鼠巨噬细胞制备实验前三天每只小鼠腹腔注射1％可溶性淀粉1ml。实验时眼球放血、断椎处死小鼠，碘酒、洒精消毒皮肤，剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用镊子夹起腹膜剪开一小口(注意避开血管)用生理盐

2、水(或1640)灌注腹腔，收集腹腔液于试管中(约4ml)，1500r/min，离心10min，去上清，沉积细胞用生理盐水(或1640)洗二次，离心转速、时间同上。最后沉积细胞用含10％小牛血清1640配成适当浓度备用(1~2×106／ml)。(2)被吞噬物的制备1）．鸡红细胞制备从鸡翼下抽取静脉血，加入5倍量Alsever液(2.05g葡萄糖，0.42gNaCl，0.8g枸橼酸钠5H2O、0.55g枸椽酸，加双蒸水到100ml，加热溶解后过滤分装，8磅高压灭菌，4℃保存)，置4℃可以保存1个月。用前取适量鸡红细胞悬液，用PBS洗涤二次后配成1％的浓度备用。2）．白色念珠菌制备将白色念珠

3、菌接种于沙氏平皿培养基中，培养48小时，收集菌，用适量生理盐水配成悬液，100℃，煮沸30min灭活，离心去掉上清，再用1％美兰染色30min，用生理盐水洗涤二次，用生理盐水配成1×108／ml菌悬液，4℃冰箱保存备用。3、操作取巨噬细胞0.5ml加1％鸡红细胞或l×l08／ml白色念珠菌悬液0.5ml，置37℃温育30min。取2滴混合液置玻片上加盖玻片，在高倍镜下观察计数，或离心1000r／min,10min，取细胞沉淀混悬液制成涂片，甲醇固定，姬姆萨染色、油镜观察计数。吞噬率％=(吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/100个巨噬细胞)×100％吞噬指数％=100个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞总数

4、/100个巨噬细胞**(吞噬指数式中巨噬细胞为阳性吞噬细胞)（三）小鼠巨噬细胞吞噬功能试验（体内法）[原理]巨噬细胞具有吞噬大颗粒异物的特性，通常选用鸡红细胞作为吞噬颗粒，将其注入小鼠腹腔中，腹腔中巨噬细胞则将鸡红细胞吞入。取小鼠腹腔液涂片、染色后可见鸡红细胞被吞噬的现象，计数100个吞噬细胞中吞噬鸡红细胞的细胞数可判断其吞噬功能。[材料]1．1％鸡红细胞悬液。2．小白鼠。3．6％可溶性淀粉肉汤肉汤培养液100m1加入可溶性淀粉6g，混匀后煮沸灭菌4．瑞氏染液。5．解剖小器械一套、无菌注射器、显微镜等。[方法]1．试验前3天，于小白鼠腹腔内注射6％可溶性淀粉肉汤1ml。2．试验当天于每

5、只小鼠腹腔内注射0.5ml1％鸡红细胞悬液，并轻揉腹部。3.注射后30min，将小鼠处死、取腹腔液涂片并行瑞氏染色。4．油镜观察涂片。[结果观察]镜下可见吞噬细胞细胞核呈蓝色，被吞噬的鸡红细胞胞浆呈红色，而核则染成蓝色(鸡红细胞有细胞核)。计数100个吞噬细胞，并计算吞噬阳性细胞的百分率。[注意事项]1．小白鼠腹腔注射时注意不要刺伤内脏。2．如小鼠腹腔液过少时，可注入适量的生理盐水。3．被吞噬的鸡红细胞时间过长可被消化，时间过短则尚未被吞噬，因此须掌握好时间。