流式细胞术检测巨噬细胞吞噬功能的方法建立

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1、流式细胞术检测巨噬细胞吞噬功能的方法建立【摘要】　　目的：建立用流式细胞术检测小鼠腹腔诱导的巨噬细胞吞噬功能的方法。方法：用贴壁法筛选有活性的巨噬细胞，再与用碳酸盐缓冲液制备的荧光素(FITC)标记的大肠埃希菌混合，37℃孵育，每10min取少量固定后加EB染巨噬细胞核，用流式细胞仪检测，计算巨噬细胞对大肠埃希菌的吞噬率。结果：FITC能够有效标记大肠埃希菌；小鼠腹腔诱导的巨噬细胞能够吞噬大肠埃希菌，并且在30min时达到最大峰值。结论：用流式细胞术检测小鼠巨噬细胞吞噬FITC标记大肠埃希菌是测定巨噬细胞吞噬功能简便、快速和重复性好的定量方法。【关键

2、词】巨噬细胞吞噬作用大肠埃希菌流式细胞仪　　EstablishaNeetry　　AbstractObjective:TouseaneethodofdetectingphagocytosisofmacrophageinducedfromtheBellyofmousebyfloetry.Methods:Firstly,thelivingmacrophagescoli(E.coli)ixedacrophages,every10minutetotakeoutofsmallamountsofmixedliquor,andaddalittleofEBdye.Fi

3、nally,thefluorescentintensityeasuredbyfloetry.Results:TheE.coliinute.Conclusion:ThemethodthatdetectingphagocytosisofmacrophagephagocytizsE.coliisconvenient、fast、goodrepeatability.Keyacrophage;phagocytosis;bacteriumcoli;floetry　　巨噬细胞(macrophage，MP)是机体天然免疫的主要免疫细胞，吞噬率则直接反映巨噬细胞的吞噬功

4、能。通常测定吞噬率的方法是对吞噬细菌的MP染色后在显微镜下观察、计数的方法，也有研究者用流式细胞仪(Floetry，FCM)检测MP的吞噬功能［1,2］。我们在检测小鼠MP吞噬细菌的实验中发现，小鼠MP的形态较小，染色后在显微镜下观察计算吞噬率较为困难。本研究试建立用流式细胞术FITCEB法检测MP的吞噬功能，以求找到一种简便、客观和重复性好的方法。　　1材料和方法　　1.1实验材料　　1.1.1主要试剂　　FITC；EB；2%淀粉肉汤；大肠埃希菌DH5A；2%琼脂LB固体培养基；含血清培养基；流式细胞仪四色校准微球(CaliBRITEBeads，

5、美国BD公司)。　　1.1.2实验动物　　BALB/C小鼠，25只，体重(19±2)g,由本院免疫学教研室保存提供。　　1.1.3主要仪器和软件　　隔水恒温培养箱，型号：GNP9270(上海精宏实验设备有限公司)；自控式CO2细胞孵育箱,型号：2300（美国Shellab公司）；分光光度计，型号：Jenager.A1(蔡司光学仪器（上海）国际贸易有限公司)；流式细胞仪，型号：FACSCalibur(美国BD公司)；CellQuest软件。　　1.2实验方法　　1.2.1大肠杆菌培养及标记荧光素(FITC)　　接种大肠杆菌于2%琼脂LB固体培养基表面

6、皿上，在37℃隔水恒温培养箱中孵育48h，取少量菌落用PBS洗，革兰氏（图1）和GP，再采集红色荧光强度，并计算实际吞噬率（某时刻实际吞噬率=某时刻吞噬率-0min时的吞噬率），同时取少量GW染色观察（图3）。　　1.3统计分析采用SPSS11.0软件进行统计分析，数据以±s表示，P＜0.05为有统计学意义。　　2结果　　2.1小鼠巨噬细胞吞噬FITC标记大肠埃希菌的定量观察由大肠埃希菌的革兰氏染色图像（图1）可以看出：大肠埃希菌为革兰氏阴性菌，并没有其他细菌污染，可以应用于吞噬实验；由大肠埃希菌的荧光显微镜观察（图2）可以看出：用碳酸盐缓冲液(

7、pH=9)制备的荧光素(FITC)能够有效标记大肠埃希菌；在不同时间段GP功能最常用的方法之一就是检测其对细菌的吞噬率，传统方法是取外周血与细菌混合作用后涂片染色，在显微镜下观察MP对细菌的吞噬率。该方法一般要寻找200个以上MP中吞噬细菌MP数量，操作较烦琐，且形态较小，显微镜下观察其对细菌的吞噬率更为困难。因此，已有研究者报道用流式细胞术测定中性粒细胞对荧光素标记细菌的吞噬功能［4,5］，但目前有关巨噬细胞吞噬功能的检测报道不多。本研究在前人研究基础上［6］，选择FITC和EB双荧光性物质标记法检测MP对大肠埃希菌的吞噬功能。其检测原理是：首先

8、利用FITC在碳酸盐缓冲液中标记大肠埃希菌，再用MP吞噬标记后的大肠埃希菌，吞噬完成后，加入EB染料标记MP