流式细胞术检测巨噬细胞吞噬功能的方法建立论文

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1、流式细胞术检测巨噬细胞吞噬功能的方法建立论文【摘要】目的：建立用流式细胞术检测小鼠腹腔诱导的巨噬细胞吞噬功能的方法。方法：用贴壁法筛选有活性的巨噬细胞，再与用碳酸盐缓冲液制备的荧光素(FITC)标记的大肠埃希菌混合，37℃孵育，每10min取少量固定后加EB染巨噬细胞核，用流式细胞仪检测，计算巨噬细胞对大肠埃希菌的吞噬率。结果：FITC能够有效标记大肠埃希菌；小鼠腹腔诱导的巨噬细胞能够吞噬大肠埃希菌，并且在30min时达到最大峰值。结论：用流式细胞术检测小鼠巨噬细胞吞噬FITC标记大肠埃希菌是测定巨噬细胞吞噬功能简便、快速和重复性好的定量方法。【关键词】巨噬

2、细胞吞噬作用大肠埃希菌流式细胞仪EstablishaNeetryAbstractObjective:TouseaneethodofdetectingphagocytosisofmacrophageinducedfromtheBellyofmousebyfloetry.Methods:Firstly,thelivingmacrophagescoli(E.coli)ixedacrophages,every10minutetotakeoutofsmallamountsofmixedliquor,andaddalittleofEBdye.Finally,theflu

3、orescentintensityeasuredbyfloetry.Results:TheE.coliinute.Conclusion:ThemethodthatdetectingphagocytosisofmacrophagephagocytizsE.coliisconvenient、fast、goodrepeatability.Keyacrophage;phagocytosis;bacteriumcoli;floetry巨噬细胞(macrophage，MP)是机体天然免疫的主要免疫细胞.freeletry，FCM)检测MP的吞噬功能［1,2］。我们在检测

4、小鼠MP吞噬细菌的实验中发现，小鼠MP的形态较小，染色后在显微镜下观察计算吞噬率较为困难。本研究试建立用流式细胞术FITCEB法检测MP的吞噬功能，以求找到一种简便、客观和重复性好的方法。1材料和方法1.1实验材料1.1.1主要试剂FITC；EB；2%淀粉肉汤；大肠埃希菌DH5A；2%琼脂LB固体培养基；含血清培养基；流式细胞仪四色校准微球(CaliBRITEBeads，美国BD公司)。1.1.2实验动物BALB/C小鼠，25只，体重(19±2)g,由本院免疫学教研室保存提供。1.1.3主要仪器和软件隔水恒温培养箱，型号：GNP9270(上海精宏实验设备

5、有限公司)；自控式CO2细胞孵育箱,型号：2300（美国Shellab公司）；分光光度计，型号：Jenager.A1(蔡司光学仪器（上海）国际贸易有限公司)；流式细胞仪，型号：FACSCalibur(美国BD公司)；CellQuest软件。1.2实验方法1.2.1大肠杆菌培养及标记荧光素(FITC)接种大肠杆菌于2%琼脂LB固体培养基表面皿上，在37℃隔水恒温培养箱中孵育48h，取少量菌落用PBS洗，革兰氏（图1）和GP，再采集红色荧光强度，并计算实际吞噬率（某时刻实际吞噬率=某时刻吞噬率-0min时的吞噬率），同时取少量GP功能最常用的方法之一就是检测

6、其对细菌的吞噬率，传统方法是取外周血与细菌混合作用后涂片染色，在显微镜下观察MP对细菌的吞噬率。该方法一般要寻找200个以上MP中吞噬细菌MP数量，操作较烦琐，且形态较小，显微镜下观察其对细菌的吞噬率更为困难。因此，已有研究者报道用流式细胞术测定中性粒细胞对荧光素标记细菌的吞噬功能［4,5］，但目前有关巨噬细胞吞噬功能的检测报道不多。本研究在前人研究基础上［6］，选择FITC和EB双荧光性物质标记法检测MP对大肠埃希菌的吞噬功能。其检测原理是：首先利用FITC在碳酸盐缓冲液中标记大肠埃希菌，再用MP吞噬标记后的大肠埃希菌，吞噬完成后，加入EB染料标记MP，在

7、488nm的激光下MP内大肠埃希菌上的FITC首先发出绿色荧光，其荧光又可以激发MP上的EB染料，使其产生红色荧光，通过计算红色荧光的表达率反映MP对大肠埃希菌的吞噬功能。实验结果显示：0～20min内吞噬率逐渐增加；30min左右吞噬率达到平台，与有关资料一致；40min以后吞噬率反而减少，有可能通过MP内溶菌酶作用把MP内细菌消化、分解，释放到细胞外，导致MP内细菌减少,荧光能力减弱。其中，在流式细胞仪荧光强度直方图中CV平均值为3.9%，由此可见，自动流式细胞仪用于检测巨噬细胞吞噬功能，不但测量数据准确性高、重复性好、操作简便、快速，而且保持MP细胞膜

8、的完整性，能够直接体现MP对细菌的吞噬能力，同时弥补