DB32∕T 3683-2019 猪链球菌9型PCR检测技术规程.pdf

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1、ICS11.220B41DB32江苏省地方标准DB32/T3683—2019猪链球菌9型PCR检测技术规程TechnicalregulationforPCRdetectingStreptococcussuisSerotype92019-12-03发布2019-12-25实施江苏省市场监督管理局发布DB32/T3683—2019前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由江苏省农业科学院提出并归口。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准主要起草人：倪艳秀、何孔旺、周俊明、祝昊丹、吕立新、

2、俞正玉、王丹丹、张雪寒、温立斌、李彬。IDB32/T3683—2019猪链球菌9型PCR检测技术规程1范围本标准规定了猪链球菌9型PCR检测技术所用的仪器设备和主要试剂、引物、方法步骤、结果判定、废弃物处理和防止污染的措施等要求。本标准适用于猪链球菌9型的PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T541兽医诊断样品

3、采集、保存与运输技术规范《病死及病害动物无害化处理技术规范》（农医发〔2017〕25号）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1猪链球菌9型Streptococcussuisserotype9属于链球菌属的一种细菌，根据其荚膜多糖抗原的差异，可分为1-31、33及1/2共33个血清型。猪链球菌9型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是一种人兽共患病病原菌。4仪器设备和主要试剂4.1仪器设备高速离心机、水浴锅、PCR仪、核酸电泳仪、凝胶成像系统。4.2主要试剂生理盐水、

4、超纯水、蛋白酶K、2×PCRMix、琼脂糖（电泳级）、DNA分子量标准（DL2000Marker）。5引物5.1上游引物：5′-GGCTACATATAATGGAAGCCC-3′。5.2下游引物：5′-CCGAAGTATCTGGGCTACTG-3′。6方法步骤6.1样品处理6.1.1病料样品处理1DB32/T3683—2019采用差速离心法，取约5g病料（肝或肺或脑组织），剪碎研磨，用5mL生理盐水混悬，先2000r/min离心2min，去除大组织块，取上清液，后10000r/min离心5min，弃上清液，

5、沉淀以200µL超纯水重悬，备用。6.1.2待检培养物样品处理取待检液体培养物（纯培养物或混合培养物）1mL10000r/min离心5min，弃上清，沉淀以200µL超纯水重悬，备用。阴性对照：THB培养基。阳性对照：猪链球菌9型标准菌株（22083）的THB培养物。阴性、阳性对照也同样处理，对每个样品进行编号标记。6.2DNA提取取6.1获得的样品及对照，每200µL加入3µL蛋白酶K（20mg/mL），42℃作用1h，煮沸5min，10000r／min离心5min，上清作为模板DNA。6.3PCR扩增

6、6.3.1反应条件按25µL体系进行，2×PCRMix12.5µL，上游引物（10pmol/µL）1.0µL，下游引物（10pmol/µL）1.0µL，模板DNA2.0µL，超纯水8.5µL。按如下条件进行PCR反应。95℃5min，然后进入循环94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35个循环，于72℃延伸10min，4℃保存。6.3.2电泳将PCR反应产物于1.2%琼脂糖凝胶进行电泳，电压为120V，时间30min。6.3.3结果观察用凝胶成像系统观察结果，并进行拍照。7结果判定7.1检

7、测结果成立条件阳性对照的PCR产物电泳后在389bp的位置上出现一条特异性条带，阴性对照PCR产物电泳后没有条带（见附录A），检测结果成立；否则，结果不成立。7.2结果判定7.2.1在检测结果成立的前提下，如果检测样品中PCR产物电泳后在389bp的位置上出现一条特异性条带，判为阳性，即该样品为猪链球菌9型核酸阳性。7.2.2在检测结果成立的前提下，如果检测样品中PCR产物电泳后在389bp的位置上未出现一条特异性条带，判为阴性，即该样品为猪链球菌9型核酸阴性。7.2.3如果阳性对照无相应的目的条带，可能

8、是存在操作失误，该检测需要重复进行；如果阴性对照有相应的目的条带，可能是阴性对照存在污染或是操作失误，该检测需要重复进行。8废弃物处理和防止污染的措施检测过程中的废弃物，应做好无害化处理。检测过程中防止交叉污染的措施见附录B。2DB32/T3683—2019附录A(资料性附录)猪链球菌9型PCR产物电泳图M122000bp——1000bp——750bp——500bp————389bp250bp——100bp——M——DNA分子