DB32∕T 2957-2016 鲤疱疹病毒Ⅱ型PCR检测方法.pdf

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1、ICS65.150B50备案号：51404-2016DB32江苏省地方标准DB32/T2957-2016鲤疱疹病毒Ⅱ型PCR检测方法PCRinspectionspecificationofcyprinidherpesvirusⅡ2016-09-20发布2016-11-20实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T2957-2016前言本标准按GB/T1.1–2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》要求进行编写。本标准由江苏省海洋与渔业局提出。本标准起草单位：江苏省水生动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：

2、陈辉、袁锐、方苹、倪金俤、刘训猛、陈静、郭立新、吴亚锋IDB32/T2957-2016鲤疱疹病毒Ⅱ型PCR检测方法1范围本标准规定了鲤疱疹病毒Ⅱ型（cyprinidherpesvirusⅡ）检测方法的试剂和材料、仪器和设备、采样、检测步骤和结果判断。本标准适用于鲫鱼疱疹病毒病病原的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法SC/T70

3、14-2008水生动物产地检疫采样技术规范3试剂和材料3.1水符合GB/T6682-2008中一级水的规格。(该水用来配置规范性附录A中所列试剂)3.2无水乙醇3.3十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）3.4TaqDNA聚合酶及配套的10×PCR缓冲液TaqDNA聚合酶或ExTaqDNA聚合酶，生化试剂，-20℃保存。10×PCR缓冲液为该酶配套的相应反应缓冲液，生化试剂，-20℃保存。3.5MgCl2（25mmol/L）：生化试剂，-20℃保存。3.6dNTPs混合物含dATP、dTTP、dCTP、dGTP各10mmol/

4、L的混合物，-20℃保存。3.75×TBE电泳缓冲液（按附录A的规定）。3.86×DNA上样缓冲液（按附录A的规定）。3.9引物及扩增片段鲤疱疹病毒Ⅱ型DNA聚合酶基因扩增引物：P1：5’-CCCAGCAACATGTGCGACGG-3’，P2：5’-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3’。扩增片段大小为362bp。注：该引物为扩增鲤疱疹病毒Ⅱ型DNA聚合酶基因的通用引物。3.10DNA分子量标准1DB32/T2957-2016宜使用DNAmarker2000，各片段大小依次为：2000bp，1000bp，750b

5、p，500bp，250bp，100bp，也可使用其他合适的DNA分子量标准。3.11阳性对照阳性对照为已知受鲤疱疹病毒Ⅱ型感染，且PCR检测结果为鲤疱疹病毒Ⅱ型阳性并经测序验证的DNA模板，-20℃保存。3.12阴性对照好阴性对照为已知未受鲤疱疹病毒Ⅱ型感染，且PCR检测结果为鲤疱疹病毒Ⅱ型阴性的组织，提取DNA，-20℃保存。3.13空白对照灭菌双蒸水（无DNA酶）。3.14核酸染色剂TMGoldview核酸染料或其他宜使用的核酸染料。4仪器和设备4.1台式高速离心机：最高转速可达12000rpm以上。4.2普通冰箱：

6、具有冷藏箱，-20℃以下冷冻箱体。4.3PCR仪。4.4电泳仪：输出直流电压0-600V。4.5水平电泳槽。4.6凝胶成像仪。4.7水浴锅或者金属浴。5采样5.1采样数量按SC/T7014-2008中6.1的规定执行。5.2个体要求活鱼或濒死的鱼。5.3采样部位有临床症状的鱼，如体长不超过4cm，取鳃；体长为4cm~6cm，取鳃和内脏（包括肾）；体长大于6cm，则取脑、肝、肾、脾和鳃组织。无症状的鱼取肾、脾、鳃和脑组织。性成熟雌鱼还需取卵巢液。2DB32/T2957-20165.4操作要求5.4.1采样及样品前处理过程中

7、应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。5.4.2镊子，剪刀等取样工具需要进行灭菌（湿热灭菌为121℃，20min；干燥灭菌为160℃，3小时）。5.4.3实验室以外的环境下采得的组织样品需用液氮及时保存。6检测步骤6.1DNA抽提6.1.1取100mg左右待检新鲜组织与300μLCTAB溶液研磨匀浆，置于1.5mL离心管内。加入450uLCTAB溶液并混匀，65℃放置2h。6.1.2加入600μL酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）至样品离心管中，持续上下颠倒用力混合至少1min，12000r/min4℃离心10min，小心

8、取上层水相（约700μL）置于新的1.5mL离心管中。6.1.3加入700μL氯仿-异戊醇（24:1），用力混合至少30s，12000r/min4℃离心5min，小心取上层水相（约600μL）置于新的1.5mL离心管中。6.1.4加入-20℃预冷的1.5倍体积无水乙醇（约900μL），倒转数次混匀后，置-20℃沉淀1