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《GBT27644-2011禽疱疹病毒2型荧光PCR检测方法.pdf》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、Ics11.220B41a宦中华人民共和国国家标准GB/T27644--201禽疱疹病毒2型荧光PCR检测方法Protocolofreal—timePCRfordetectingGallidHepersVirus22011-12-30发布2012-04-01实施宰瞀鳃鬻瓣訾糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会促19标准分享网www.bzfxw.com免费下载刚禹GB/T27644--201本标准按照GB/Tll1--2009的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本标
2、准起草单位:中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、扬州大学、河南农业大学。本标准主要起草人:詹爱军、刘文博、王新卫、卢体康、花群义、陈书琨、秦智锋、陈兵、高小博。标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围禽疱疹病毒2型荧光PCR检测方法本标准规定了禽疱疹病毒2型荧光PCR检测的操作方法。本标准适用于禽疱疹病毒2型的鉴定及其流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件GB/T27644—2011下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的
3、修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。ct值:每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。DNA:deoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸。dNTP:deoxy-ribonucleosidetriphosphate三磷酸脱氧核糖核苷。含有dCTP、dGTP、dATP、dTTP四种脱氧核糖核苷。EDTA;ethylenediarninetetraaceticacid乙二胺四乙酸。GHV2:GallmHepersVirus2禽疱疹病毒2型(马立克氏病病毒血
4、清1型)。MD:Marek’SDisease马立克氏病。PBS:phosphatebelaneedsolution磷酸盐缓冲生理盐水。PCR:polymerasechainreaction聚合酶链式反应。Real—timePCR:Real—timepolymerasechainreaction实时荧光聚合酶链反应。Taq酶:Thermusaquaticuspolymerase耐热DNA聚合酶。4试剂4.1试剂级别:除另有规定,本方法试验用水应符合GB/T6682规定的二级水,所用化学试剂均为分析纯。4.2禽疱疹病毒2型荧光PCR检测试
5、剂盒,一20℃保存,组成及使用注意事项参见附录A。4.3引物和探针序列(产物长度142bp)上游引物:5’CCACCACCTCCCATCTGTAC3’下游引物:5’GACAAGGCTGAGCGTAAAcc3’TaqMan探针:5’AcAcGGcTcGGTAAcAGGAcAcAATG3’,其5’端和3’端分别标记FAM和BHQ(或Tamra或Eclipse)。4.41%肝素钠,配制方法见B.1,4℃保存。4.5三氯甲烷,常温保存。1标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB/T27644—20114.6异丙醇,使用前预冷至--20
6、℃。4.7无水乙醇。4.875%乙醇,采用无水乙醇和灭菌双蒸水配制,使用前预冷至一20℃。4.90.01mol/LPBS,pH7.2,配制方法见B.2。5器材和设备5.1无菌注射器,1mL,5mL,10mL,25mL,100mL。5.2一次性无菌塑料袋。5.31.5mL无DNA酶和RNA酶的Eppendorf管。5.40.2mL无DNA酶和RNA酶的PCR薄壁管、八联管或96孔板。5.5荧光PCR检测仪。5.6高速台式冷冻离心机,可控温至4℃、离心速度可达120009以上。5.7振荡器。5.8研钵。5.9普通冰箱和超低温冰箱:规格2℃
7、~8℃,--20℃,一80℃。5.10微量移液器,0此~2pL,lpL~10止,10vL~100儿,20pL~200此,100止~1000pL,并配备与移液器匹配的无DNA酶和RNA酶的吸头。6样品的采集和处理6.1样品的采集6.1.1全血用预先加入1%肝素钠的无菌注射器直接吸取全血至无菌Eppendorf管中,盖上管盖并编号。6.1.2羽毛和组织脏器取待检羽毛OA根部挤出少量羽髓)、肝脏、肾脏和脾脏样品装入一次性塑料袋或其他灭菌容器,编号,送实验室。6.2样品贮运样品采集后,放人密闭的塑料袋内(一个采样点的样品,放一个塑料袋),于保
8、温箱中加冰、密封,送实验室。6.3样品处理6.3.1全血30009离心30min,取棕黄色层转人无菌的1.5mLEppendor{管中,加入500pLPBS洗涤,30009离心15min,弃上清,编号备用。6.3.2羽毛
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