溶血素含量检测.doc

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1、实验小鼠血清溶血素含量测定一、血清溶血素（抗体）分光光度检测法【实验原理】抗原（绵羊红细胞，即SRBC）进入机体，刺激机体产生特异性抗体（溶血素，即抗SRBC抗体）；抗原抗体在体内外结合形成抗原抗体复合物，暴露出补体的C1q结合点，激活补体，导致绵羊红细胞溶解。通过检查机体产生抗体的量，反映机体的免疫功能状态。【实验目的】掌握血清抗体（溶血素）含量的测定方法。【试剂与器材】1．小鼠，绵羊红细胞，补体；2．都氏试剂或蒸馏水；3．试管，吸管，钳子，镊子，微量加样器，水浴箱，分光光度计（540nm）。【操作方法】1．把SRBC用

2、生理盐水洗3次（1000～2000转/分，5分钟），弃上清，3﹕5（V/V）用生理盐水稀释SRBC浓度约为20亿个/ml。2．实验前4天，每鼠腹腔注射SRBC0.2ml；3．免疫4天后取血，分离血清；4．用生理盐水适当稀释血清（200倍左右）；5．取1ml稀释后的血清加入反应管，再加0.5ml10%SRBC，置冰浴中，每管加入1ml补体；6．将反应管移至37℃水浴中，10分钟后再把其移至冰浴中；7．2000转/分离心10分钟，再取上清1ml，加入3ml都氏试剂（或蒸馏水）混匀，10分钟后用分光光度计（540mn）测定吸光度

3、；8．另取一试管作测定实验用的SRBC半数溶血时的吸光度值。取同实验用的10%SRBC0.25ml，加4ml都氏试剂，摇匀，10分钟后用分光光度计测定吸光度。【结果】按下式计算样品的半数溶血值HC50：样品HC50=样品的吸光度值×稀释倍数SRBC半数溶血时的吸光度值【注意事项】在操作过程中，严格遵守冰浴时间，以控制反应时间的一致性。【作业】计算出样品的溶血素值。附：二、微量溶血检测法（一）实验原理同血清溶血素分光光度检测法。（二）实验材料1．小鼠、绵羊红细胞、补体（1：20）。2．PBS（含Ca2+、Mg2+）。3.试管

4、、吸管、96孔板、微量加样器、水浴箱、酶标仪等。（三）实验方法1．动物免疫：每鼠腹腔注射10%SRBC0.2ml，5天后取血，分离血清。2．PBS将血清作1：25～1：3200递减稀释，加入96孔板，每孔0.1ml，继而依次加入等量的0.2%SRBC和豚鼠血清（1：20稀释），实验孔总体积为0.3ml。同时设血清对照、补体对照、SRBC对照及PBS空白对照（调零用），实验均设4个复孔。3．置37℃温箱温育1小时，然后离心（2000转/分）10分钟，取上清液150μl放入另一96孔板内，置酶标仪（A415）测定。