木本植物的遗传转化.ppt

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1、实验三木本植物的遗传转化农杆菌农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。农杆菌介导法含有Ti质粒的致癌农杆菌与一些植物的细胞接触后，Ti质粒的一部分（T-DNA）可以导入植物细胞，整和到植物基因组DNA随其复制。根据这一特性可构建一系列Ti质粒载体，与含目的片段的DNA片段重组，导入致癌农杆菌，再采用叶盘法、原生质体培养法、细胞培养法，通过致癌农杆菌介导进入植物细胞。根癌农杆菌（Ti质粒）Ti质粒是约200-500kb的环状DNA分子，Ti质粒具有五个主要功能区域，

2、它们分别是T-DNA、质粒转移(plasmidtransfer)、冠瘿碱代谢(opinecatabolism)、复制原点(ori)和毒性区域(vir)。T-DNA中直接参与转移并整合到植物染色体上的序列，仅是T-DNA两端与其它序列交界处的25bp不完全直接重复(imperfectdirectrepeats)，右端的序列称为右界(rightborder,RB),左端的为左界(leftborder,LB)。T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，将其它序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内

3、的序列转移并整合到植物基因组。Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的。,实验目的掌握遗传转化的原理和操作技术。初步掌握农杆菌介导转化植物的方法。农杆菌介导法原理Ti(tumorinducing)质粒是根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)所特有的质粒，是天然的基因载体，可高效整合到植物细胞的基因组中。农杆菌Ti质粒中心T-DNA在毒性区Vir基因的作用下，转入植物细胞，并插入植物基因组中共同复制与表达。材料、设备及试剂材料：叶片设备及试剂：超净工作台、离心机、振荡培养箱、试剂瓶、培养皿、酒精灯等。Kan、利福平(rif)、Y

4、EB、乙醇等。（1）工程菌液的制备（2）外植体消毒将叶片用解剖刀切成小块，浸泡在次氯酸钠中10min，用无菌水洗3次，每次1-2min。（3）预培养以叶片作受体材料，选择完全展开、深绿色的叶片，横过叶片的主脉剪2-3下，放到诱导分化培养基上进行预培养3d。（4）、侵染在超净工作台上，将工程菌液倒入无菌三角瓶中，将预培养的叶片浸入工程菌液中，5min.（5）共培养取出外植体在无菌滤纸上吸干菌液，将叶片放入新的培养基中，共培养。（提前倒平板）（6）脱菌与选择培养暗培养结束后的叶片，在超净工作台中转入含有头孢唑啉钠的培养基中，进行除菌。一周后进行选择培养。（

5、7）诱导芽生长、生根，形成转化植株实验步骤：步骤：农杆菌的活化（1）工程菌液的制备挑单克隆测OD600=0.5收集细胞用液体LB培养基重悬细胞稀释20-50倍2、外植体消毒将叶片用解剖刀切成小块，浸泡在次氯酸钠中10min，用无菌水洗3次，每次1-2min3、预培养以叶片作受体材料，选择完全展开、深绿色的叶片，横过叶片的主脉剪2-3下（如图1），放到诱导分化培养基上进行预培养，预培养时间分为3d。图1用于预培养的叶片右：用于转化；左：不宜作转化外植体体左，4、侵染在超净工作台上，将工程菌液倒入无菌三角瓶中，将预培养的叶片浸入工程菌液中，浸泡为5min.

6、5、共培养取出外植体在无菌滤纸上吸干菌液，将叶片放入新的培养基中，共培养。（提前倒平板）在含有选择压力的培养基上诱导细胞分化，形成转化芽6、脱菌与选择培养暗培养结束后的叶片，在超净工作台中转入含有头孢唑啉钠的培养基中，进行除菌。一周后进行选择培养。诱导芽生长、生根，形成转化植株Ⅲ-2选择生根培养（Kan15mg/L）左，转化植株；右，非转化植株Ⅲ-4非转化植株的生根左，不含卡那霉素；右，卡那霉素浓度15mg/L实验报告简述植物遗传转化的过程共培养时需要注意哪些问题？