植物遗传转化技术.ppt

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1、第四章植物遗传转化技术植物遗传转化是指以植物器官、组织、细胞或原生质体作为受体，通过某种技术或途径转入外源基因，获得使外源基因稳定表达的可育植株的过程。植物遗传转化植物遗传转化方法植物遗传转化常用的方法1、载体法转化——农杆菌介导法（Ti质粒）2、非载体介导的遗传转化（1）基因枪法（2）超声波法（3）脂质体法（又称融合法）（4）电转化（5）花粉管转化将待转化的DNA沉淀在细小金属珠的表面，用特制枪将金属珠直接打入植物细胞，枪的威力为430m/s，植物细胞通常是胚胎细胞、玉米籽、叶片等，但进去的DNA片段整合效率极低。1基因枪转化法将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生质体悬

2、浮液中，混合物在200-600V/cm的电场中处理若干秒，然后将原生质体在组织培养基中生长，再生出整株植物。2电击法将外源DNA与特殊的疏水性高分子化合物混合，在水中这些疏水性化合物分子形成球状的脂质体，后者与植物细胞原生质体融合，筛选融合子，再生植物细胞壁。所有涉及到植物原生质体的基因转化方法均存在一个难题，即：原生质体再生出整株植物比较难。3融合法外源DNA沿着花粉管经过珠心进入尚未形成正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中，从而实现基因的转移。这一方法是我国科学家周光宇首先提出设计的，目前已应用于水稻、小麦、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的转基因研究。4花粉管导入法花粉管导

3、入法的特点是直接、简便。受体材料为植株整体，省略了细胞组织培养的诱导和传代过程，排除了植株再生的障碍，特别适合于难以建立有效再生系统的植物。由于转化的是完整植株的卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞，导入的DNA分子整合效率较高。几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型Ti（Tumor-inducing）质粒介导的。5农杆菌介导植物遗传转化载体作为植物遗传转化的载体，必须具有两种功能：1.它能作为媒介将外源基因导入植物细胞中去，并且整合到宿主细胞

4、的基因组DNA上；2.它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的DNA序列。人们很早就发现双子叶植物常发生一种冠瘿瘤病，该病在法国、东欧和意大利的葡萄和果树上曾大面积发生。1907年首先发现这种冠瘿瘤病是由根癌农杆菌引发的。农杆菌的Ti质粒电镜下的根癌农杆菌冠瘿瘤1974年Zaenen等在根癌农杆菌内发现并分离了一种与肿瘤诱导有关的大型质粒（大于200kb），称为Ti质粒。1977年Chilton等在研究农杆菌侵染后形成的植物肿瘤细胞时，用分子杂交发现在肿瘤细胞中存在着农杆菌Ti质粒的一个片段，称为T-DNA（Transfer-DNA）。实验表明，T-DNA转移到植物细胞后整

5、合进植物基因组中并得以表达，从而导致了冠瘿瘤的发生。进一步研究发现，整合到植物基因组中的T-DNA可以通过减数分裂稳定地传给植物的后代。Ti质粒的上述特性成为农杆菌介导法植物遗传转化的重要基础。Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质；双股共价闭合的环状DNA分子；T-DNA能够插入到植物基因组中并能稳定表达；长度150-200KB；植物基因工程常用的载体。根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同分：章鱼碱型（octopine）胭脂碱型（nopaline）农杆碱型（agropine）琥珀碱型（agrocinoine）章鱼碱的遗传图胭脂碱的遗传图Ti质粒结构T-DNA区、毒

6、性区(vir)、质粒复制起点(ori)、质粒结合转移位点(con)、冠瘿碱分解位点(ocsornos)Ti质粒结构左边界LB右边界RB生长素合成基因细胞分裂素合成基因冠瘿碱合成基因合成基因Vir基因复制起始位点Con区Onc基因Vir区（毒性区）：与T-DNA区彼此相邻，约占Ti质粒总长度的1/3；该区段上的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞的遗传过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现毒性；Vir区段总长度约35kb，由7个互补群组成；毒性区中各位点的表达情况分为两种：组成性表达植物诱导性表达Vir基因的功能：诱导根癌农杆菌附着到植物受伤的部位上–VirA蛋白；产物诱导T-

7、DNA形成单股DNA片段--VirD蛋白；将T-DNA转入植物细胞，整合到寄主基因组中--VirD、E蛋白；T-DNA基因被表达，使植物细胞增殖并产生冠瘿碱。T-DNA（TransferDNA）是农杆菌侵入植物细胞时从Ti质粒上转移到植物细胞的一段DNA；T-DNA两端个有一段25bp的同向重复序列，是T-DNA的边缘区。LB；RB在同一条单链的LB和RB内各形成一个缺口，单链T-DNA进入植物细胞损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它们能诱导Ti质粒上的vir基因以及根瘤菌染色体上的一个