植物遗传转化方法和技术ppt课件.ppt

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1、第四章植物基因工程1植物基因工程是近20年来随着DNA重组技术、植物遗传转化技术及植物组织培养技术而发展起来的现代生物技术。通过植物基因工程获得转基因植物，在农业生产发展及植物分子生物学研究中有十分重要的意义。目前，已获得很多有重大经济价值的转基因植物。2基因工程的基本步骤目的基因的获取基因载体的选择与构建目的基因与载体的拼接重组子导入受体分子外源基因的表达和产物的分离重组子的检测34本节主要内容根癌农杆菌介导法基因枪介导法其它转化方法第一节植物遗传转化方法5常用的植物转基因方法：到目前为止,已确立了11种植物转基因方法。根据其转化原理，可分为三大类，

2、即利用载体的转化系统，不用任何载体，采用物理、化学方法直接将外源基因导入受体细胞的直接转化系统以及利用植物生殖细胞等种质媒介的种质转化系统。现将这三大类系统的载体、转化原理、转化方法和受体细胞等归纳如图4-1。67一、根癌农杆菌介导法根癌农杆菌介导法的分子机制农杆菌介导法需要具备的条件农杆菌介导法的基本流程81、植物冠瘿瘤——植物的一种癌症（1）冠瘿瘤的起因：由根癌农杆菌对植物的侵染而引起。（2）冠瘿瘤的侵染过程：细菌通过伤口进入植物，在基因水平上转化植物。细菌DNA中的编码基因在植物细胞中表达，刺激植物细胞不受控制的分裂，形成瘤。（一）根癌农杆菌介导

3、法的分子机制92、Ti质粒根瘤农杆菌染色体外的遗传物质，为共价闭合环状的DNA分子。10为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力；参与寄主细胞合成激素的能力；诱发植物产生冠瘿瘤；赋予寄主分解冠瘿碱的能力；决定寄主范围。（1）Ti质粒的功能11（2）Ti质粒的功能区域T-DNA区Vir区Con区Ori区200kb12①T-DNA区（transferred-DNAregions）：核心区左边界右边界T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，故称之为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。13Vir区是一段长度为3

4、5KB操纵子；包含六个基因：VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG。该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质粒DNA的三分之一。②Vir区操纵子基因的结构与功能LBRBT-DNAVir14③Con区（regionsencodingconjugations）该区段上存在着与细菌接合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。④Ori区（originofrepli

5、cation）该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。15定向转移到寄主植物细胞内T-DNA链整合植物基因组受伤植物产生酚类物质，诱导Vir基因的表达编码核酸内切酶依次在RB、LB序列中产生缺口单链T-DNA被释放3、T-DNA转移的机制植物细胞酶体系合成双链T-DNA链分子VirE2蛋白的核定位作用164、植物遗传转化的载体系统一元载体（顺势载体）双元载体（反式载体）17①Ti质粒分子量过大，一般在160～240kb；②分布各种限制酶的多个切点；③T-DNA区内含有许多编码基因，干扰宿主植物中内源激素的平衡，转化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的

6、分化和植株的再生；④Ti质粒不能在大肠杆菌中复制,即使得到重组质粒，也只能在农杆菌中进行扩增；⑤Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的基因。野生型Ti质粒不能直接作为植物基因工程载体：185、农杆菌介导的转化质粒的构建PG2TNOSAmprPG1T目的基因报告基因，选择标记基因目的基因报告基因，选择标记基因LBRB19启动子的选择35S,cauliflowermosaicvirus35SpromoterCaMV35Sisastrongpromoterthatisactiveinessentiallyalldicotplanttissues

7、.20（二）农杆菌介导法需要具备的条件高效的植物基因转化受体系统受体植物细胞对农杆菌要有很高的亲和力。具有有效的选择系统。稳定的转化技术和基因表达。211、高效的植物基因转化的受体系统成功的基因转化首先依赖于良好的植物受体系统的建立。受体系统：用于转化的外植体通过组织培养途径或其它非组织培养途径（如发苗产生子叶、胚轴等），能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。22A.植物基因转化受体系统的条件（1）高效稳定的再生能力（2）较高的遗传稳定性（3）具有稳定的外植体来源（4）对选择性抗生素敏感（5）对农杆菌侵染有敏

8、感性（6）具有经济价值或理论研究意义。23B.植物基因转化受体系统的类型1.愈伤组织再生系统外