SDS-PAGE电泳具体步骤.doc

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1、SDS电泳具体步骤一、清洗玻璃板1、洗洁精轻轻擦洗2、自来水冲3、蒸馏水冲4、筐里晾干5、梳子用水洗二、配胶材料：玻璃板、梳子、架子、枪（100-1000、20-200、2-20）、DDW、30%Arc-Bis、Tris(pH8.8)、Tris(pH6.8)、10%SDS、10%AP、TEMED。1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧2、配分离胶3、加入玻璃板中4、加入乙醇1ml等待０.5小时5、用注射器吸出乙醇，6、用水冲洗分离胶3次，第4次最后(加入AP、TEMED前)再用注射器吸出7、配浓缩胶8、将玻璃板加满9、放入小梳子等待０.5小时三、上样材料：蛋白、marker、针筒、电泳槽、电

2、泳液、枪（2-20ul）1、把玻璃板取下，放入小架子，固定于电泳槽（大玻璃板朝外），拔梳子，（若只有一块胶，对面用塑料板）2、将小架子加满电泳液，标记位置，用针筒抽电泳液通膜3、根据要求上样蛋白（如海马），最外侧加马克，用2-20ul枪四、电泳1、放入电泳盒中，盒中加少量电泳液，放上盖子2、开电泳机电压先60V，马克到达分离胶后调制110V，等待约2小时五、转膜材料：6张滤纸、1张PVDF膜（根据分离胶剪，无水甲醇中浸泡1min~2min）、转膜夹、转膜缓冲液1、取胶，将浓缩胶轻轻刮去，去掉多余的分离胶，2、将裁好的胶、浸过甲醇的PVDF膜和滤纸放入转膜缓冲液中，10min左右，3

3、、黑色板在下面，纸—胶—膜—纸（注意赶走气泡）4、转膜夹放入电泳槽，放满转膜缓冲液，外面放冰块，加满水等待120分钟，电压100V六、免疫反应材料：丽春红、TBST、5%牛奶、一抗、二抗1、取出一小盒，加入少量丽春红，（用完回收）2、把膜取出，扔掉胶，依次放丽春红——TBST，（摇床上)3、膜剪成小条带，放入方格盒，放入TBST（摇床），几分钟后放入5%牛奶中封闭抗原（摇床）等待1小时4、配一抗：配5%的牛奶（5g牛奶，加TBST至100ml），将抗体放入牛奶中。5、包一抗：将膜放入盛有抗体的5%的牛奶中，摇床上1小时6、4℃冰箱中过夜7、第2天，取出膜，TBST中洗，10分钟X3

4、次8、加入二抗，封膜，摇床上，1.5—2h七、化学发光准备材料：黄色枪头、20-200ul枪、剪刀、镊子、保鲜膜、板、solution、reagent、小盒中的膜1、取出膜，TBST中洗，10分钟X3次2、膜放入盒中3、加solution、reagent至膜上，（A：B=1：1，约60ul）4、膜放入保鲜膜上包好5、膜放入板上进屋6、剪胶片放在膜上下，夹在板里，等待1小时7、胶片先放入显影液中8、胶片先放入定影液中9、用水冲洗干净