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1、中国生物工程杂志第24卷第9期CHINABIOTECHNOLOGY2004年9月滚环DNA扩增的原理、应用和展望1*213肖乐义祁自柏姜俊张子宽(1河南省科学院郑州4500032国家药品生物制品检定所北京1000503河南康鑫生物技术有限公司郑州450003)摘要滚环DNA扩增(rollingcircleDNAamplification,RCA)是一种等温信号扩增方法,其线性扩增59倍数为10,指数化扩增能力大于10,产生的扩增产物连接在固相支持物(如玻片、微孔板等)表面的DNA引物或抗体上。RCA是一种适合在芯片上(on2chip)进行信
2、号扩增的新技术,它既能提供研究分析的敏感性和特异性,又能保持立体分析的多元性。RCA亦是一种痕量的分子检测方法,可用于极其微量的生物大分子和生物标志的检测与研究。关键词滚环DNA扩增phi29DNA聚合酶微阵列痕量检测生命科学研究需要一种敏感、特异和准确地定病毒,常常是通过滚环扩增的机理实现的。作为一性或定量方法。从基因组学、一般基因序列变异或种实验方法,线形滚环扩增是把一条寡核苷酸引物单核苷酸多行性蛋白组学到肿瘤标记物、激素等,退火到环型DNA模板,在引物和dNTP存在时通过其中某些物质的量是极其微小的。因此,生命科学环型模板的循环扩增而
3、延长。RCA的指数化扩增9[1]5[3]家一直在研究或挖掘新颖的、强有力的方法以便更能力大于10倍,其线形扩增为10倍。好地满足生命科学研究的需要。滚环DNA扩增或在单一引物RCA中,一个环型DNA(扩增模滚环复制(rollingcirclereplication,RCR)可能是达到板)、一条DNA引物,在一种DNA多聚酶的作用[1]这一目标的方法之一。下,以这个环型DNA为模板,催化dNTP合成单链RCA是一种等温信号扩增方法,产生的扩增产DNA联聚分子,该分子由上千个反复衔接的环型物连接在固相支持物(如玻片)表面的DNA引物DNA链的拷
4、贝构成(图1)。多引物RCA(multiply2上。因此,RCA是一种适合在芯片上(on2chip)进行primedRCA)是由一个环型DNA模板和多条DNA信号扩增的新技术,既能提供研究分析的敏感性和引物组成的RCA扩增(图2)。与其它扩增反应相特异性,又能保持立体分析的多元性。因为微阵列反,RCA产生的单链的扩增产物,其一端仍然连接(microarray)对微量靶基因检测敏感性较差,因而,在固相支持物的DNA引物上,因此,RCA非常适合[2]通常与液相预扩增方法如PCR或T7聚合酶扩增固相形式的微阵列之局部特异信号的检测。RCA联合应用
5、。然而,这些扩增方法在涉及高度多元性这一与众不同的性质适合于同时分析检测许多目核酸检测中(如微阵列)的应用有其局限性,由于反标分子(多元性)而不互相干扰。应物及各个扩增产物互相干扰,导致扩增效率和特在RCA反应中,短的单链环型DNA作为DNA异性的下降。此外,芯片外(off2chip)靶基因扩增策聚合酶(最常用的是phi29DNA聚合酶、有时是RNA[4~6]略明显增加了操作复杂性并导致序列依赖的定向聚合酶或bstDNA聚合酶)的模板,产生大量偏差,适合芯片上扩增的RCA可能是未来生物芯的、相互衔接的DNA拷贝。体外病毒DNA复制系片发展和
6、普及使用不可缺少的检测手段。统的phi29DNA聚合酶有两个特点:(1)phi29DNA聚合酶有高度的扩展性和聚合酶活性,这种活性不1滚环DNA扩增的原理需任何附加蛋白质的帮助;(2)聚合酶本身就能产自然界里,环型DNA分子的复制,例如质粒或生链替代反应。这种酶的DNA链合成能力大于70kb,增加模板链次级结构的稳定性不影响酶的扩[7]展性和链取代能力。此外,该系统还可用于收稿日期:2004203222修回日期:2004206228电子信箱:xlyhightech@163.netmRNA的分析和研究,可显著提高检测的敏感性并34中国生物工程
7、杂志第24卷[8]可同时分析多种RNA分子。与RCA相反,PCR和其它液相扩增方法不能在免疫RCA,寡核苷酸引物共价结合在抗体在芯片上进行扩增(on2chipamplification),其原因可上,如果有环型DNA、DNA聚合酶和dNTP存在,就能为:(1)在扩增位点扩增产物扩散进液相而不能能产生一条含数百个环型DNA链拷贝的DNA长积累扩增信号;(2)热循环过程中产生的有害物质链,这条DNA链仍然连接在固相支持物的抗体上,对反应组分的影响;(3)反应物和扩增产物的相互可用多种方法进行检测(图3)。免疫RCA具有高反应和干扰,导致扩增效率
8、和特异性的下降;(4)芯度敏感性和非常宽的动力学范围和前所未有的单片外(off2chip)扩增较多地增加了操作程序与时间,分子检测能力。免疫RCA微阵列可进行定性和定并可产生序列
