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时间:2020-06-05
《microRNA反转和定量引物设计(看完就会设计自己的引物).doc》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、以hsa-miR-145为例设计引物,其成熟体序列为:GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU一设计引物1反转录之后扩增所需引物设计反向引物(反转之后跑PCR所需的引物):每个反向引物的都带有一段固定的序列,可以形成一个茎环,固定的序列为:5,-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3,在这个序列后加上八个碱基,这八个碱基是hsa-miR-145从后面数八个碱基的反向互补序列,就是GAAUCCCU的反向互补:AGGGATTC,最后得到的反向引物的序列为5
2、,-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGGGATTC-3,2定量引物设计正向引物:每个正向引物也带有一段固定的序列,固定的序列为:ACACTCCAGCTGGG在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列,成熟体除掉后面六个碱基后序列为:GUCCAGUUUUCCCAGGA,把U变成T即可,最后的序列为:5,-ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3,URP(unifiedreverseprimer):统一反向引物,也是一段固定
3、的序列,TGGTGTCGTGGAGTCGU6引物上游引物CTCGCTTCGGCAGCACA下游引物AACGCTTCACGAATTTGCGT二使用方法:1反转录之后跑PCR的引物:所有要做的miRNA反向引物的混合,每个10微升2RT-PCR的引物:50微升的体系,30微升的水,10微升的正向引物,10微升的URP(内参50微升的体系,30微升的水,10微升U6的正向引物,10微升U6的下游引物)
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