microRNA反转和定量引物设计原理实验方法.doc

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1、microRNA的引物设计以ssc-miR-222-3p为例设计引物，其成熟体序列为：AGCTACATCTGGCTACTGGGTCT反向引物：每个反向引物的都带有一段固定的序列，可以形成一个茎环，固定的序列为：5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3，在这个序列后加上八个碱基，这八个碱基是ssc-miR-222-3p从后面数八个碱基的反向互补序列，就是CTGGGTCT的反向互补：AGACCCAG，最后得到的反向引物的序列为5，-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATT

2、CAGTTGAGAGACCCAG-3， 正向引物：每个正向引物也带有一段固定的序列，固定的序列为：ACACTCCAGCTGGG在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列，成熟体除掉后面六个碱基后序列为：AGCTACATCTGGCTACT5，-ACACTCCAGCTGGGAGCTACATCTGGCTACT-3， URP：统一反向引物，也是一段固定的序列，TGGTGTCGTGGAGTCGU6引物F-CTCGCTTCGGCAGCACA，R-AACGCTTCACGAATTTGCGT使用方法：1逆转的引物：所有要做的miRNA

3、反向引物的混合，每个10微升2PCR的引物：50微升的体系，30微升的水，10微升的正向引物，10微升的URP2．hsa-miR-124（hsmq-0032引物）推荐退火温度：60℃hsa-miR-124扩增曲线示意图hsa-miR-124融解曲线示意图3．hsa-miR-125b(hsmq-0034引物)推荐退火温度：60℃hsa-miR-125b扩增曲线示意图hsa-miR-125b融解曲线示意图4．hsa-miR-137(hsmq-0035引物)推荐退火温度：60℃hsa-miR-137扩增曲线示意图hsa-miR-1

4、37融解曲线示意图5．hsnRNAU6引物测试推荐退火温度：60℃hsnRNAU6扩增曲线示意图hsnRNAU6融解曲线示意图6.电泳结果取5μlPCR产物进行电泳,胶浓度（3％）,所有检测都为两个阳性,一个NTC其中泳道1为hsa-miR-16、泳道2为hsa-miR-124、泳道3为hsa-miR-125b、泳道4为hsa-miR-137、泳道5为hsnRNA-U6[img]