反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求

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1、反转录引物的选择与Real-TimePCR引物设计的要求1）随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。2）Oligo(dT)：是一种仅对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Po

2、ly(A+)RNA只占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。特别适合检测多个基因的表达，这样可以节约反转录的试剂，cDNA可以多次使用，可用于检测稀有基因是否表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平。3）特异性引物：最特异的反转录方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。做R

3、ealTimePCR时，用于SYBRGreenI/EvaGreen法时的一对引物与一般PCR的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：①Tm=55-65℃②GC=30-80%③PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-300bp之间都可。④引物的退火温度要高，一般要在60℃以上。要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的

4、影响。至于设计软件，PRIMER3，PRIMER5，PRIMEREXPRESS都应该可以的。做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不易。五、cDNA与引物质量检测取0.2ml薄壁PCR管，编号。向各管中加入含染料2×PCRTaqMix10ul；加入正反向引物各0.5ul（引物浓度10uM），向管中加入混合的cDNA各1ul。各管补加水至20ul。组份加量2×PCRTaqMix10ul10uMPrimer

5、FW0.5ul10uMPrimerRV0.5ulTemplateDNA1ulddH2O混匀至20ul混匀，置于TP600PCR仪中。95℃5min；95℃15s，60℃35s，40cycles；72℃5min；4℃pause。取扩增产物各8μl，DL2000分子量标准5μl/泳道。1%琼脂糖凝胶120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察。选择特异性好，扩增效率高的引物作为实时荧光使用引物。六、利用相对定量的方法分析目的基因表达量的情况：由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等

6、客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。七、定量PCR检测：取0.2ml薄壁PCR管，分别编号。向各管中加入2×qPCRTaqMix12.5ul，10uM各基因正反向引物混合物0.5ul，对应的cDNA各1ul。一管中不加模板用作阴性对照。各管补加水至25ul。组份加量模

7、板(cDNA)/ddH2O1.0ul10uM引物F/R0.5ul2×qPCRMix12.5ulddH2O11.0ul混匀，置于SLAN荧光定量PCR仪中。95℃5min预变性后，95℃15s→65℃35s（荧光检测），40cycles。荧光定量PCR一般把退火和扩增设成一个温度，只在扩增出现问题时才会考虑设梯度。八、扩增曲线和溶解曲线溶解曲线全部为单峰表明为特异性扩增。一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期，其形状是一条平滑的S型曲线。如果在荧光背景信号阶

8、段出现很多拐点，可能的原因是体系未混匀或者存在固态杂质；如果向下探头后又很快抬头然后又向下探头，可能原因是体系中模板量太高，建议模板稀释后再用。如果引物二聚体存在则阴性对照会出现抬头现象，这在Real-TimePCR中很难避免；若是阴性对照的溶解曲线出现和样品中同样的峰，说明体系配置中存在污染，则实验结果不可用。在溶解曲线中出现双峰有三种可能：①引物峰，引物峰通常是两峰中的前面一个，消除的办法是降低体系中的引物量或重新设计引物；②在做基因表