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1、第32卷分析化学(FENXIHUAXUE) 评述与进展第2期2004年2月ChineseJournalofAnalyticalChemistry248～254反相液相色谱在蛋白质及多肽分离分析中的应用3朱晓囡 苏志国(中国科学院过程工程研究所,生化工程国家重点实验室,北京100080)摘 要 反相液相色谱是一种以疏水作用为基础的色谱分离模式。由于它具有分辨率高、重复性好、回收率高等优点,在蛋白质及多肽的分离分析中得到了极为广泛的应用。本文简要介绍了反相液相色谱及其分离机理,对其在蛋白质和多肽研究中的应用如分离纯化、肽图分析
2、、酶活测定、构象变化检测及疏水作用研究等作系统综述,并展望了反相液相色谱在这一领域的发展前景。关键词 反相液相色谱,蛋白质,多肽,纯化,分析,评述1 引 言20世纪80年代以来,随着生命科学研究的不断深入,用于多肽及蛋白质分离纯化的色谱方法得到了很大发展。其中,反相液相色谱由于具有许多其它色谱方法不可比拟的优势,正受到人们的关注。它能有效地分离各种多肽混合物,特别适用于分子量不大的蛋白质和多肽物质的分离、纯化和鉴定,在蛋白质及多肽研究中已得到了广泛的应用。近年来,随着基因组和蛋白质组计划的实施,对不同蛋白质的快速分析、定
3、性以及定量的需求更大,反相液相色谱以其快速简便、灵敏度高、重复性好、分辨率高等优势受到人们的重视,已成为一种常备的不可缺少的分析手段,并用于多肽药物分离中。反相液相色谱与各种质谱技术的结合也已成为蛋白质结构分析的重要手段和发展方向。2 反相液相色谱2.1 简介反相液相色谱(reverse2phaseliquidchromatography,RPLC)是目前液相色谱分离中使用最为广泛的一种模式,它的特点是固定相的极性比流动相弱。与它相对应的是正相液相色谱或极性相液相色谱(nor2mal2phaseliquidchromato
4、graphy),如硅胶、氧化铝或离子交换等极性介质为固定相的色谱,其中流动相的极性低于固定相。由于RPLC固相载体的疏水性,它可以根据流动相中被分离物质分子疏水性的不同而发生强弱不同的相互作用,从而使不同分子在反相柱中彼此分离。疏水性较弱的样品分子和固定相间的相互作用较弱,因此较快流出;反之,疏水性相对较强的分子和固定相间存在较强的相互作用,在柱1内保留时间相对较长。RPLC在20世纪50年代就已用于许多有机小分子的分离和分析,80年代后逐2步应用于生物大分子如蛋白质、多肽、核酸的鉴定,并用于制备规模的分离。RPLC与其它
5、色谱方法相比具有分辨率和回收率高、重复性好、操作简便等优势。由于RPLC可使用挥发性体系如水溶三氟乙酸(TFA)2乙腈(ACN),纯化产物不必进行脱盐,因此,可大大简化操作步骤。另外,在其它模式的色谱中,保留时间主要决定于天然蛋白质分子表面的某些基团与固定相配基间的相互作用。而在RPLC中,蛋白质分子通过色谱柱时会发生或多或少的去折叠,内部某些疏水残基暴露并与固定相相互作用,从而表现出与其它色谱及电泳方法不同的选择性,提供其它方法不能提供的信息,3这成为RPLC在蛋白质及多肽分离分析中的又一个有利因素。由于以上种种原因,R
6、PLC已成为广泛使用的一种分离模式,普遍用于多肽和蛋白质的分离分析。2.2 分离机理RPLC分离与流动相中溶质分子与固定相配基间的疏水相互作用有关。人们对于反相分离中这种2002206230收稿;2003209201接受本文系国家自然科学基金资助项目(No.20136020)第2期朱晓囡等:反相液相色谱在蛋白质及多肽分离分析中的应用249疏水作用的本质进行了大量的研究,提出了许多不同理论,但对其机理尚未达成共识,RPLC中的保留行4,5为究竟是一种吸附过程还是分配过程还存在很多争论。目前,根据理论分析和实验数据证明,一些5
7、～7研究者认为溶质在RPLC上的保留是吸附机制和分配机制共同作用的结果。对于较小分子而言,人们更多考虑其分配机制;而对于多肽和蛋白质这样的生物大分子,由于其分子尺度往往比固定相表面疏水键合相大得多,通常以表面部分区域与固定相发生作用,其保留机制多被认为是主要基于它们在疏2,8,9水固定相上的吸附。简单地说,在多肽及蛋白质的RPLC中,初始洗脱条件下洗脱液中有机成分浓度较低,分子与固定相疏水作用较强,几乎完全被固定相吸附。而一旦洗脱液中有机成分达到特定浓度,使得多肽或蛋白质与固定相间作用小于流动相与固定相间的作用时,分子完全
8、从固定相上洗脱下来,几乎不再与固定相发3生作用。这一保留机制也被人称为“on2off”机制。正由于多肽和蛋白质这种特殊的保留机制,洗脱液成分极微小的改变就会大大影响多肽和蛋白质的保留行为,从而保证疏水特征相近的多肽或蛋白质得1以充分分离。3蛋白质及肽段分离中常常采用反相离子对色谱(reversed2ph
