柞蚕血球细胞体外培养及对核型多角体病毒的感染研究.pdf

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1、辽宁农业科学2012(3)：7一l0LiaoningAgricuhuralSciences文章编号：1002—1728(2012)03—0007—04柞蚕血球细胞体外培养及对核型多角体病毒的感染研究岳冬梅，王林美，李树英，范琦，叶博，赵振军，张波(辽宁省农业科学院大连生物技术研究所，辽宁大连116024)摘要：分别采用Grace、TC．100和MGM-448加20％胎牛血清和10％苯基硫尿做为细胞原代培养基，在27℃，pH6．2～6．4的条件下，对5龄柞蚕(Antheraeapernyi)幼虫血球细胞进行体外培养，

2、发现细胞在培养1h后基本贴壁，在相差倒置显微镜下观察三种培养基细胞形态各异，原代培养的细胞主要是椭圆形、梭形和不规则形，进行了45d培养试验，观察结果表明：三种培养基中Grace培养基优于其他两种，其新生细胞增殖较快，细胞透明，大约10d左右即基本长满瓶底，15d进行第一次传代，传代培养细胞主要以园形和椭圆形为主。利用Grace培养基培养传代第2代的细胞进行柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)的感染实验，通过相差倒置显微镜和电子显微镜观察呈现出典型的细胞病理变化，感染7d细胞感染率可达75％。关键词：柞蚕；血球细胞；细

3、胞培养；核型多角体病毒中图分类号：Q813文献标识码：A昆虫的细胞培养是伴随着病毒学的研究发展的同源离体细胞的表达系统，进行了大量的柞蚕起来的。昆虫细胞培养发端于1915年，第一血细胞的体外培养和感染病毒的试验，现将初步个试图进行昆虫组织细胞培养的是德国Richard结果报导如下：Goldschmidt。他使用惜比古天蚕(Hyalophorace．1材料与方法cropia)蛾的精子进行体外培养，用来观察精子的发育(GoldsehmidtandKaiser，1915)，50年代，1．1材料加拿大SilverWyatt

4、研究了家蚕卵巢细胞培养条1．1．1实验材料来源件，设计了第一个最成功的昆虫细胞培养基IPL．供试5龄柞蚕幼虫来自辽宁省蚕业研究所。16。60年代，Grace改进了Wyatt培养基，使之柞蚕核型多角体病毒(以下简称ApNPV)毒种由进一步完善，至今已利用它建立了许多细胞本实验室制备。系，并广泛用于昆虫细胞系的培养与研究。1．1．2主要仪器和试剂20世纪80年代，人们建立了杆状病毒表达相差倒置荧光显微镜(Leica，德国)、超净工载体系统(BaeulovirusExpressionVectorSystem，作台(苏州苏

5、净集团)、低速离心机(上海安亭科BEVS)。现今已广泛应用于重组蛋白的高效表学仪器厂)、细胞培养瓶及吸管(江苏江阴科学器达’近几年来，以昆虫杆状病毒作为外源基因材公司)。MGM-448培养基¨¨的所有组分均购载体的基因工程的研究发展较快，为了探索柞蚕自SIGMA公司，由本实验室配制，Grace培养基核型多角体病毒(Antheraeapernynuclerpolyhe—和TC一100培养基均购自GIBCO公司，胎牛血清drosisvirus，ApNPV)作为基因工程运载体的研购自美国HYCLONE公司。究，有人已经对

6、ApNPV的理化性质作了一些研究，在ApNPV离体表达系统的研究方面，无论1．2方法是在筛选同源的和异源的敏感细胞方面都有人作1．2．15龄柞蚕幼虫血球细胞的获取及培养方了一些有益的探索，作者为了寻找更加敏感法，收稿日期：2012—02—07资金项目：辽宁省自然科学基金项目(201102098)作者简介：岳冬梅(1978一)，女，助理研究员。Te1：0411-84790092E-mail：dongmeiyue78@hotmail．COnl辽宁农业科学取5龄健康柞蚕幼虫，饥饿24h后，用75％圆形居多，培养15d新生

7、细胞长满瓶底，进行第乙醇浸泡20rain进行体表面消毒，用灭菌双蒸水一次传代(图A一2)。每隔7d按1：1传代1次，洗涤3次，将幼虫置无菌纱布上吸干体表水分，用传至第4代发现新生细胞数量减少，聚集拉伸，随已消毒的眼科剪刀无菌条件下剪断幼虫腹足，采后细胞膜加深，细胞变暗，传代未能维持。(图A血淋巴5滴滴人装有lml培养液的细胞培养瓶3)。中，其培养液用Grace、TC．100、MGM-4483种，分2．1．2TC一100培养基培养的5龄柞蚕血球细胞别添加20％FBS和】0％苯基硫尿，每m1培养液初期，相差倒置显微镜下

8、观察细胞基本贴壁，形态各含青霉素、链霉素100单位，于27℃培养箱中以椭圆形和梭形为主，细胞内有少量颗粒。(图静止培养，7d换液1次，每次换掉一半培养B一1)培养3d后细胞开始聚集，10d可见聚集的液。细胞周围有新生细胞出现，形态多数以圆形和椭1．2．2病毒悬液的制备圆形为主，细胞透明，悬浮，培养15d进行第一次取解除滞育的柞蚕蛹体壁穿刺接种ApNPV传代(