基于强阳离子交换色谱与等电聚焦的磷酸化蛋白质组学分离策略比较.pdf

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1、第40卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第2期2012年2月ChineseJournalofAnalyticalChemistry177～183基于强阳离子交换色谱与等电聚焦的磷酸化蛋白质组学分离策略比较隋少卉董俊军王京兰蔡耘钱小红(防化学院三系，北京102205)(军事医学科学院放射与辐射医学研究所，蛋白质组学国家重点实验室，北京蛋白质组研究中心，北京102206)摘要比较分析了强阳离子交换(SCX)与等电聚焦(IPG-IEF)技术在磷酸化蛋白质组学中的应用。采用3种标准磷酸化蛋白对SCX与IPG-IEF两种技术对磷酸化肽

2、段富集的有效性进行考察。以HepG2细胞为复杂样本，考察SCX与IPG-IEF在实际样本中的应用情况。对SCX与IPG-IEF技术在O标记的磷酸化蛋白质组定量研究中的应用情况进行考察。蛋白鉴定采用高准确度、高灵敏度、高分辨率的LTQ-FTICR-MS／MS质谱仪。实验表明：SCX和IPG-IEF在大规模磷酸化肽段分离过程中均有效；在复杂样本中，SCX技术的分离效果优于IPG-IEF；IPG-IEF的重复性好于SCX；在磷酸化蛋白质组定量分析结果表明，IPG-IEF技术的稳定性优于SCX。本研究为根据不同实验目的而选择适当的磷酸化蛋白质

3、组预分离技术提供了有用信息。关键词磷酸化肽段分离；强阳离子交换；等电聚焦；傅里叶交换离子回旋质谱l引言磷酸化修饰是调节细胞内蛋白活性和信号传导的重要翻译后修饰之一。因此获得磷酸化蛋白和磷酸化位点的信息对深入理解细胞的调节过程和信号传导是十分重要的。虽然细胞内能发生磷酸化的蛋白较多，但磷酸化蛋白的量却很少，而且蛋白磷酸化的动态性以及特定的磷酸化位点的化学计量值较低等因素使得磷酸化蛋白的鉴定，特别是大规模的磷酸化蛋白质组学分析十分困难。鉴于此，对磷酸化肽段进行预分离，降低样本的复杂性，从而提高磷酸化肽段的相对浓度，是十分必要的l5]。目前

4、，已建立了一些磷酸化肽段富集策略，如固相金属亲和色谱(Immobilizedmetalaffinitychroma—tography,IMAC)同，强阳离子交换色谱(Strongcationexchange，SCX)，二氧化钛(TiO2)，等电聚焦(IsoelectricfocusingonanimmobilizedpHgradientgel，IPG-IEF)等技术Ⅻ。其中IMAC和TiO2技术常用于大规模磷酸化肽段联合富集路线中的二维富集。自Beausolfil等将SCX成功应用到磷酸化肽段的富集后，SCX已成为大规模磷酸化蛋白质组

5、联合富集路线中最常用的一维分离技术。近期，以IEF为分离原理的技术被引进，用于分离胰蛋白酶酶解肽段混合物，该技术可能成为大规模磷酸化蛋白质组学分析中联合富集路线中的一维分离技术。为了考察IEF和SCX的有效性，本研究对SCX和IPG-IEF在磷酸化蛋白质组学中的应用，包括定性和定量两方面，进行了比较研究，为根据实验目的而选择适当的磷酸化蛋白质组学预分离技术，提供了有用信息。2实验部分2．1仪器与试剂毛细管高效液相色谱一电喷雾一线性离子阱一傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(CapLC-ESI—LTQ-FTI—CR,ThermoFinniga

6、n)，毛细管色谱由安捷伦1100系统控制，由自动上样系统、上样泵(含一个十通阀)和二元洗脱泵组成(Agillent1100，Agillent公司)；ProteomeLabPF2D型两维高效液相色谱系统，包括双泵201卜03—1O收稿；201卜06-23接受本文系国家自然科学基金((Nos．20635010,20735005)，国家高技术研究发展计划(863)(Nos．2006AA02A308，2006AA02A312)资助E-mail：qianxhl@yahoo．com．cn178分析化学第4O卷反相色谱仪、自动馏分收集及进样器和32

7、Karat色谱工作站(美国Beckman公司)，并在反相色谱之后连接自动馏分收集器(Gilson公司)；IPGphor水平电泳仪(AmershamPharmacia公司)。乙腈(HPLC级，美国J．Baker公司)；三氟乙酸(TFA)和碘乙酰胺(Iodoacetamide，比利时ACROS公司)；胰蛋白酶(Trypsin，Sequencinggrade)和二硫苏糖醇(Dithiothreithol，DTT)购于美国Promega公司；HepG2细胞(北京市人民医院馈赠)；牛酪蛋白(~-Casein)、酪蛋白(Casein)、鸡卵白蛋白

8、(Ovalbumin)、旷氰基一4_羟基肉桂酸(HCCA)、NazVO3、甲酸(FA)和NaF(美国Sigma公司)；蛋白酶抑制剂(德国Roche公司)。H2O(97％，上海化工研究所)。超纯水由Millipore纯水系