毛细管等电聚焦∕加压毛细管电色谱二维分离体系在多肽分离中的应用.pdf

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1、第39卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第2期2011年2月ChineseJournalofAnalyticalChemistryl88～192D0l：10．3724／SP．J．1096．2011．00188毛细管等电聚焦／加压毛细管电色谱二维分离体系在多肽分离中的应用魏娟谷雪王彦阎超(上海交通大学药学院，上海200240)摘要以毛细管等电聚焦(cIEF)为第一维分离模式，以反相加压毛细管电色谱(pCEC)为第二维分离模式，开展离线二维色谱分离研究，并对复杂肽段进行分离。羟丙基纤维素(HPC)涂层的毛细管用于cl

2、EF分离，对6种标准蛋白质的平均分离柱效约为31万。在毛细管末端引进电隔离槽，方便了第一维样品的收集。在加电6kV下，第二维pCEC对多肽的分离比不加电时的分辨率和分离速度提高。实验中用牛血清白蛋白的酶解肽段对cIEF／pCEC二维体系进行考察，理论峰容量约为30000。将该平台用于人血红细胞破碎液酶解多肽的分离，7个片段共检测到约200个峰。结果表明，clEF／pCEC二维能较好地完成对复杂多肽的分离。关键词毛细管等电聚焦；加压毛细管电色谱；多维分析；多肽1引言随着蛋白质组学研究的不断深入，对复杂生命体系样品分离分析的需

3、要越来越迫切。多维色谱的分析方法因其高峰容量、高分辨率等特点，得到较快发展。多维技术最主要的优势在于将具有正交分离机理的色谱模式联用，获得不同寻常的峰容量。毛细管等电聚焦(clEF)的方法便是蛋白质／多肽分离中常用的分离模式。cIEF区别于其它毛细管电泳(CE)模式的全柱进样方式及很强的浓缩能力等特点，决定了它特别适合作为多维系统中的第一维。目前，已有以微进样阀为接口的clEF／毛细管反相液相色谱(CRPLc)联用[1l，以微透析中空纤维作接口实现的cIEF／毛细管等速电泳一毛细管区带电泳(CITP—CZE)[21，clE

4、F／毛细管凝胶电泳(CGE)[31等多种联用模式。加压毛细管电色谱(pCEC)结合了CE与高效液相色谱(HPLC)的双重优点，采用电压和压力联合驱动力。在双重分离机制的作用下，pCEC对于样品的分辨能力得到了极大提高。与HPLC和CE等方法相比，对带电物质，pCEC可以分别优化压力和电压条件，更好地调整分离物的保留和选择性】。pCEC克服了CEC的一些限制因素，可方便地对流动相组成和流速进行调节，抑制气泡的形成，尤其能实现梯度洗脱和定量进样旧。pCEC由于其在复杂样品中的分离优势也被用于多维系统中第二维的分析。强阳离子交换

5、(SCX)／pCEC被用在中药黄柏提取物的分离中]。Zhang等将clEF与纯CEC联用，用于蛋白质和多肽的分离。本研究将clEF和pCEC结合，不仅符合机理正交的要求，而且将二者的优势相结合。期望通过多维的分离，实现峰容量的扩增，对复杂多肽样品进行高效分析。本实验以clEF为第一维分离模式，以pCEC为第二维分离模式，开展二维离线色谱分离研究。2实验部分2．1仪器与试剂TrisepTM_2100GV毛细管电色谱仪、毛细管电泳仪(美国UnimicroTechnologies公司)；熔融石英毛细管柱(河北永年锐沣色谱器件公司

6、，cHN)。羟丙基纤维素(HPC，美国Sigma公司)；载体两性电解质Pharmalyte(pH3～10，瑞士GEHealthcare公司)；溶菌酶(美国Amresco公司)；细胞色素C、肌红蛋白、乳球蛋A、胰蛋白酶(Trypsinfrombovinepanceras，美国Sigma公司)；核糖核酸酶A、碳酸酐酶(上海楷洋生物技术，CHN)；牛血清白蛋白(BSA，2010-07-22收稿；2010-09-07接受本文系国家自然科学基金(No．20705018)、姑苏创新创业领军人才项目(No．ZGX0727)、国家科技部农

7、业科技成果转化资金(No2008002)和上海市科委科学仪器环境条件建设项目(No．09142200202)资助课题E—mail：chaoyan@unimicrotech．tom第2期魏娟等：毛细管等电聚焦／力Ⅱ压毛细管电色谱二维分离体系在多肽分离中的应用189上海申能博彩生物科技，CHN)；乙腈(色谱纯)。其它试剂为分析纯。实验用水为饮用纯净水。2．2样品处理2．2．1人血红细胞破碎液(Humanredbloodcelllysate，HRBCL)的制备取正常人全血离心弃上清液取细胞，按体积比1：9加入新配制的0．8％(w

8、／V)NHC1溶液。涡旋振荡使细胞悬浮在溶液中，在冰上放置10min，使红细胞破碎溶解，离心弃去沉淀。上清液为红细胞的破碎溶解液，4℃保存待用。用Bradford法测得红细胞破碎液中蛋白质的总浓度约为67．5g／L[。2．2．2蛋白质的酶解方法取适量BSA或HRBCL样品，用新鲜配制100mmol／LN