蛋白质等电聚焦课件.ppt

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1、第七章蛋白质等电聚焦等电聚焦简介等电聚焦原理等电聚焦技术等电聚焦注意事项等电聚焦的优缺点固相pH梯度等电聚焦等电聚焦技术的进展液体介质凝胶介质等电聚焦(isoelectrofocusing),缩写为IEF或EF，是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。等电聚焦具有分辨率高、操作简便、重复性好的优点，已广泛应用于生物化学、分子生物学、遗传学、分类学及临床医学研究中,但等电聚焦的不足是要求使用无盐溶液，而某些蛋白质在无盐溶液中溶解度低

2、，可能产生沉淀,而且样品中各组分都聚焦到其等电点，对一些在等电点不溶解或发生变性的蛋白质不适用。★一等电聚焦原理等电聚焦是依据蛋白质分子或其他两性分子的静电荷或等电点不同而进行分离的技术，等电聚焦中，蛋白质分子在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳。载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧酸，在电场中形成正极为酸性，负极为碱性的连续的pH梯度。蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有电荷，因此可以在电场中移动；当蛋白质迁移至其等电点位置时，其静电荷数为零，在电场中不再移动，就会产生聚焦现象，形成蛋白质区带，由此可将不同等电点的蛋白质分开。★二

3、等电聚焦技术目前，用于蛋白质研究的等电聚焦有多种，根据IEF时所用的支持介质的种类不同，基本上可以分为两类：一类是在液体介质中的等电聚焦。另一类是在凝胶介质中的等电聚焦，即等电聚焦凝胶电泳。以下我们将分别对这两类进行介绍。★2.1液体介质垂直柱状蔗糖密度梯度等电聚焦是原瑞典LKB公司早期用于制备和分析目的的等电聚焦方法。载体两性电解质在蔗糖密度梯度柱中形成pH梯度，样品根据他们的等电点进行分离，使用这种方法所需的时间较长。有些也使用液体介质进行制备等电聚焦。但它是水平圆柱状方式，分成20个腔。腔间用单丝聚酯筛做成的膜隔开，据称使用这种方法所需的分离时间只要

4、4小时左右，上样量可达4g。2.1.1器材与试剂配制1．聚焦柱有成品出售，分110ml和440ml两种2．电源0V~1200V可调20W的直流稳压电源3．载体两极电解质 市售25ml瓶装，浓度为40％或20％（W/V），pH范围为2.5~11，也有其它pH范围的，可根据实验条件选择购买。4．蔗糖（分析纯）5.电极液的配制见下表（表1，表2）表1正电极缓冲液的配制正极在中心管内正极在柱顶磷酸或硫酸0.05（0.2）ml或1（4）ml1Mol/L酸溶液0.025（0.1）ml或0.5（2）ml1Mol/L酸溶液H2O15（56）ml5（25）ml蔗糖11（44

5、）g表2负极缓冲液的配制此配制用量为最大用量，一般用1/5的量即可。括号内为440ml聚焦柱型号所用量配方。负极在中心管负极在柱顶氢氧化钠0.1（0.4）g或1（4）ml0.05（0.2）g或0.5（2）ml2Mol/L溶液2Mol/L溶液蒸馏水14（56）ml5（25）ml蔗糖11（44）g6．重、轻液的配制与混合⑴重、轻液的配制：配制方法见下表3表3重、轻液的配制方法此表为梯度混合器所用量，如用手工混合法则应相应适当增加20％。110ml柱440ml柱载体40％（ml）水及蛋白质溶液（ml）蔗糖（g）重液1.93726轻液0.651.5重液7.6148

6、104轻液2.4206⑵重、轻液的混合：有条件的可采用梯度混合器装柱。手工混合法操作如下：取24支试管（440ml聚焦柱则应取46支试管）按表4各加入重、轻液，充分混匀。表4重、轻液的混合配方试管号重液（ml）轻液（ml）试管号重液（ml）轻液（ml）1234567891011124.64.44.24.03.83.63.43.23.02.82.62.40.00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.02.21314151617181920212223242.22.01.81.61.41.21.00.80.60.40.20.02.42.62.

7、83.03.23.43.63.84.04.24.44.62.1.2操作方法1．决定电极的极性如pH梯度范围在6以下时，则聚焦柱底的电极为正极。如pH梯度的范围在6以上时，则柱底为负极。2．装柱 按电极的极性与电极液的要求装柱3．注入载体溶液4．加重、轻混合液5．连接冷凝水管6．电泳7．样品的收集8．测每管的pH值和蛋白含量，将相近pH的同一蛋白质的管合并9．将分离的每一样品成分过SepHadexG25（或G50），将蛋白质与载体分离开来★2.2凝胶介质利用凝胶内的缓冲液在电场作用下在凝胶内沿电场方向制造一个pH梯度。当蛋白质样品在这样的凝胶上电泳时，每种蛋

8、白质都将迁移至与它的pI相一致的pH处，具有不同pI的各种蛋白质最