磷酸化蛋白质组学中的分离富集方法研究进展

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1、磷酸化蛋白质组学中的分离富集方法研究进展【摘要】蛋白质的磷酸化是一种可逆性的翻译后修饰，在细胞的增值、分化、信号转导以及转录与翻译调控、蛋白质复合体的形成、蛋白质降解等方面发挥着极为重要的作用。因此磷酸化蛋白的鉴定成为翻译后修饰研究的重要内容。但由于磷酸化蛋白的丰度较低,难以用质谱直接检测。为了解决这个问题，改善质谱对磷酸肽的信号响应,需要对磷酸化蛋白质或磷酸肽进行富集。本文系统地介绍了磷酸化蛋白组学研究中应用较为广泛和最新建立的各种分离富集方法的原理、特点、应用研究进展，包括抗体富集法、激酶特异富集法、亲和富集法、化学修饰法

2、、多种色谱分离富集方法以及MALDI靶盘富集法。【关键词】磷酸化蛋白质组，分离富集方法，评述　　1引言　　磷酸化是蛋白质翻译后修饰最为重要的形式。据统计,哺乳动物细胞内的蛋白质有1/3以上可以被磷酸化。真核生物细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸[1]。其中，磷酸化丝氨酸最多,磷酸化苏氨酸次之，而磷酸化酪氨酸最少,三者的比例是1800∶200∶1。最新实验鉴定到三者在真核细胞的百分比为86.4%、11.8%和1.8%[2]。磷酸化蛋白在细胞信号转导、细胞的分化、增值、周期调控、新陈代谢、转录和翻译、蛋白降解和

3、细胞生存等[3]方面发挥着重要的作用。　　磷酸化蛋白在细胞生命活动中的重要作用，使其成为蛋白质组学研究的热点。但是磷酸化蛋白自身的一些特点，使得磷酸化蛋白质分析仍是一件很具挑战性的工作。首先，磷酸化蛋白质含量很低，在特定刺激下仅有少部分蛋白发生磷酸化;其次，磷酸化的可变性，使得不同条件下蛋白存在不同的磷酸化形式;再次，现有的分析方法缺乏对磷酸化位点的动态分析，使得部分位点难以鉴定。最后，磷酸酶的存在使得在样品制备过程产生脱磷酸化现象。因此对磷酸化蛋白或者磷酸化肽段进行富集,提高磷酸肽的相对含量,成为磷酸化蛋白组学研究中的重要内

4、容。　　传统分析蛋白质磷酸化的方法是用放射性同位素32P标记到磷酸化的蛋白质上，带有放射信号的蛋白质可以通过蛋白质的分离,如二维凝胶或HPLC分离及Edman测序等方法，鉴定磷酸化氨基酸类型及位点[4,5]。这种方法除了具有放射性实验的缺点以外，实验比较耗时并且不能进行高通量的磷酸化蛋白组学分析。近年来,一些富集方法不断改进及涌现，如抗体法、固相金属离子亲和色谱(Immobilizedmetalionaffinitychromatography，IMAC)、金属氧化物/氢氧化物亲和色谱(Metaloxide/hydroxide

5、affinitychromatography,MOAC)、离子交换和等电聚焦、β消除Michael加成反应等。目前各种富集方法与质谱(Massspectrometry,MS)技术的结合已成为研究蛋白质磷酸化的主要工具，逐渐取代了传统的磷酸化蛋白质分析方法。本文综述了近年来用于分离富集磷酸化蛋白和肽段的各种方法。　　2磷酸化蛋白分离富集方法　　2.1抗体富集法　　富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀,从复杂混合物中免疫沉淀目标蛋白质。已经有商品化的抗酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸磷酸盐抗体，

6、其中抗酪氨酸磷酸盐抗体最为常用。免疫沉淀技术对抗体的要求更高，抗磷酸酪氨酸抗体具有较好的亲和性可以进行免疫沉淀实验。磷酸化丝氨酸和苏氨酸的抗原决定簇较小,抗原抗体结合位点有空间障碍,抗体的结合力较差[6]，所以多年来一直没有用于免疫沉淀分析。　　Schumacher等[7]利用两种不同的磷酸化酪氨酸抗体对肿瘤细胞系SUDHL1裂解液分别经免疫沉淀和免疫亲和层析富集磷酸化酪氨酸蛋白，经质谱鉴定表明双抗免疫沉淀法可鉴定到更多的磷酸化蛋白。Pandey等[8]用抗磷酸化酪氨酸抗体免疫沉淀表皮生长因子(EGF)刺激后的HeLa细胞

7、总蛋白质和未刺激的HeLa细胞总蛋白质，通过MS分析共鉴定出7个已知的EGF激酶底物和1个新的EGF激酶底物Vav2。Chong等[9]也利用磷酸化酪氨酸抗体富集鉴定到3个新的EGF信号通路下游的靶蛋白，并且通过该方法还可对蛋白质相互作用进行研究。Gronborg等[10]对多种商品化的抗磷酸丝氨酸/苏氨酸抗体的免疫沉淀性能进行了评价，发现有3个抗磷酸丝氨酸/苏氨酸抗体可应用于免疫沉淀，并成功富集了磷酸酶抑制剂CalyculinA诱导的HeLa细胞磷酸化蛋白质。　　2.2激酶特异富集法　　很多激酶不仅以相互协同的形式动态调控

8、着信号通路，而且还通过特异位点磷酸化来调控自身以及不同激酶间的功能活性[11]。但是由于激酶相对于其底物来说丰度更低，因此在已有的磷酸化蛋白质组学研究中对于激酶的磷酸化位点的研究尤为不足。免疫沉淀技术可以用于大规模的磷酸化蛋白质组学研究，磷酸化酪氨酸蛋白特异性抗体可以用于磷酸