Phos_tag技术在磷酸化蛋白质组学中的应用

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1、《生命的化学》2010年30卷1期●技术与方法·145·CHEMISTRYOFLIFE2010，30(1)文章编号:1000-1336(2010)01-0145-04Phos-tag技术在磷酸化蛋白质组学中的应用李阳1李玉红21第三军医大学学员旅1队，重庆400038；2第三军医大学细胞学生物教研室，重庆400038摘要：Phos-tag是新研制出的一种对磷酸基团具有特殊亲和力的化合物。由于其对磷酸化蛋白质具有高特异性、高亲和力等特点使其迅速在磷酸化蛋白质的检测、分离和纯化等方面得到广泛的应用。本文综述了Phos-

2、tag的化学性质、原理及其近年来在磷酸化蛋白质组学中的应用，并与传统的磷酸化蛋白质组学研究技术做了比较，对未来磷酸化蛋白质组学的研究技术作了展望。关键词：Phos-tag；磷酸化蛋白质组学；蛋白质纯化中图分类号：Q816在蛋白质的翻译后修饰(posttranslational质捕获分子。由于Phos-tag在磷酸化蛋白质的分离、modification,PTM)中，磷酸化占有极其重要的地位，富集和稳定等方面优势突出，所以其很快就在各类蛋白质的功能调节大多是通过磷酸化修饰来实现的。磷酸化蛋白质的研究中得到了广泛应用。

3、本文综述在哺乳动物细胞周期中，大约有1/3的蛋白质发生过了Phos-tag的化学性质、原理及其在磷酸化蛋白组磷酸化的修饰，而脊椎动物基因组中有2%的基因编质学中的应用。码蛋白激酶或磷酸酶[1]。蛋白质磷酸化修饰的研究，1.Phos-tag的化学性质及基本原理对探索在细胞不同生长因子、细胞因子或其他因素Phos-tag是一种对带有磷酸基团的化合物具有的刺激下，细胞内蛋白质磷酸化状态的变化，解释特殊亲和力的金属螯合物[2](图1A)。在四个吡啶环有关的信号转导途径和生理生化机理具有重要意义。的和两个主链上两个氮原子和羟

4、基氧原子之间可螯然而，鉴于磷酸化蛋白质自身的一些特点(如含量合有如Zn2+或Mn2+等重金属原子并形成一个半封闭少、化学计量数低、易降解等)，使得磷酸化蛋白质的空间。在适当的环境条件下，该空间恰好能够容组学的研究比常规蛋白质组学更加困难。纳一个磷酸基团，使得螯合有金属离子的Phos-tag传统的磷酸化蛋白质分析中由于磷酸化蛋白质分子能够与磷酸基团牢固而稳定地结合(图1B)。含量远低于未磷酸化的蛋白质，因此磷酸化的肽段传统的固相金属亲和层析(immobilizedmetal往往很容易淹没在大量非磷酸化的肽段当中。并且

5、，affinitychromatography,MAC)技术[3]利用固相化的铁由于磷酸化的肽本身所具有的负电性，使其在正离子模式质谱分析中受到限制。除此之外，磷酰键的不稳定性也使得样品中磷酸化蛋白质的含量进一步下降。日本广岛大学的Kinoshita等[2]研制出了一种被称为Phos-tag(Phosphate-bindingtag)的磷酸化蛋白收稿日期：2009-09-27作者简介：李阳（1987-），男，临床医学八年制学员，E-mail:liyang360@163.com;李玉红（1980-），男，博士，助图1

6、Phos-tag结构式及其原理[2]教，通讯作者，E-mail:leo61999@163.com《生命的化学》2010年30卷1期·146·●TechniqueandMethodCHEMISTRYOFLIFE2010，30(1)图2Phos-tag与不同基团的亲和能力比较[5]螯合离子和金属氧化物(如TiO2等)对磷酸化蛋白质蛋白质的目的的。和磷酸化氨基酸的高选择性的结合能力,来选择性富2.Phos-tag的应用集磷酸肽。但是，其最大的一个缺点就是非特异性2.1Phos-tagSDS-PAGE在磷酸化蛋白质的分离检

7、测吸附。如果肽混合物中含有一些带较多酸性残基的中应用Kinoshita等[6]利用含Phos-tag的复合电泳胶成肽段,其酸性残基侧链上的羧基也容易与金属离子发生静电作用导致非特异性吸附[4]。而从Phos-tag在功检测和分离了多种磷酸化蛋白质，并通过一系列水溶液环境中与各种化学基团的亲和能力来看，的验证实验证明了含Phos-tag的电泳胶在分离各种同种型磷酸化蛋白质中具有独特的优势[6]，使得磷Phos-tag与磷酸基团的结合能力远远大于其他化学基团(如磺酸基、羧基等)(图2)，显示出极高的特异酸化蛋白质组学的

8、研究变得更为便捷。性，很好地解决了非特异性吸附的问题[5]。Phos-tag复合电泳胶是由螯合Mn2+的Phos-tag(Mn2+-Phos-tag)与聚丙烯酰胺凝胶共聚合而成。在反应体系的pH值对Phos-tag与磷酸基团的亲和力起至关重要的作用。由图3可以看出：在pH<3的Phos-tag复合电泳胶中进行电泳时，由于Phos-tag与酸性条件下，质子与磷