拟穴青蟹ANT2基因的克隆与低温胁迫表达分析.pdf

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1、第53卷第3期厦门大学学报(自然科学版)Vol

2、53NO．32014年5月JournalofXiamenUniversity(NaturalScience)May2014拟穴青蟹ANT2基因的克隆与低温胁迫表达分析于坤，叶海辉，巩杰，黄辉洋，林思恒(厦门大学海洋与地球学院，福建厦门361102)摘要：腺苷酸转移酶(ANT)是线粒体中最丰富的蛋白质之一，其主要作用是介导ADP／ATP在细胞质和线粒体基质之间的运输．为探讨该基因在拟穴青蟹(Scyllaparamamosain)低温适应中的作用，采用反转录PCR(RTPCR)、eDNA末端快速扩增技术(RACE)等技术，从拟穴青蟹中获得了ANT

3、2的cDNA全长序列，并运用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测了ANT2在不同组织和不同温度下的表达谱．该序列全长1348bp，开放阅读框(ORF)为930bp，编码309个氨基酸残基．同源分析显示，该蛋白具有3个保守的线粒体跨膜功能结构域，形成能量分子传导转运通道，催化细胞质中ADP和线粒体内ATP的跨膜交换．qPCR结果表明ANT2基因在拟穴青蟹多个组织中均有表达，且表达量不同，表明ANT2基因具有组织表达特异性．第1期仔蟹在10，15，20，25℃不同温度条件下，在1，3，12，24，36h，10和15C组表达量显著低于2O和25℃组(Pd0．05)；且在1，3，6。12，24h

4、，10。C组的表达量显著低于15℃组表达量(d0．05)．15C组在48h内，ANT2呈现高低起伏的表达模式．拟穴青蟹第1期仔蟹ANT2基因表达变化，提示该基因与能量代谢功能相关，可能参与拟穴青蟹低温胁迫应答．关键词：拟穴青蟹；ANT2；低温胁迫；实时荧光定量PCR(qPCR)中图分类号：Q785；S917．4文献标志码：A文章编号：04380479(2014)03043607低温作为一种外界环境因子会改变生物机体内有研究表明，ANT2基因与生物体耐寒机理相关，环境的稳定性，进而影响生物的生理和行为等．在低温可能参与调控生物机体的耐寒生理过程．有关甲壳动胁迫下，生物主要活动是增加产热，以维

5、持恒定的体物ANT的研究尚少．据报道，丰年虾(Artemiafran温l1]，同时生物体能够启动与抗低温相关的基因，使ciscana)胚胎中的ANT蛋白与钙离子运输密切相组织细胞内抗低温相关蛋白的表达发生变化_2，从而关[9]．凡纳滨对虾(LitopenaeusvanHaei)ANT2基抵抗低温环境对机体产生的影响．因表达变化可能与低温胁迫有关【腺苷酸转移酶(adeninenucleotidetranslocase，迄今，有关温度对甲壳动物生理生态的影响，国内ANT)是线粒体中最丰富的蛋白质之一，它将线粒体外已有不少研究报道_l，但拟穴青蟹(Scyllapara内合成的三磷酸腺苷(ATP)

6、转运到胞浆供能，并将胞mamosain)与低温相关性尤其在基闲水平的报道很浆二磷酸腺苷(ADP)转入线粒体内通过氧化磷酸化少I”]．拟穴青蟹是我国东南沿海重要的海洋经济蟹类之一[1产能J．ANT蛋白由两个完全相同，分别含一个．作为暖水性种类，在季节交替或低温寒潮发生期间，拟穴青蟹不适应低温环境，严重时会发生病害引起ATP／ADP结合位点的亚基组成，通过其构象的变化，死亡[1．本研究采用cDNA末端快速扩增技术(rapid实现细胞质中ADP和线粒体内ATP间的跨膜交amplificationofcDNAends，RACE)技术得到拟穴青蟹换l4]．生物体大约1／2～l／3的基础电子传递由AN

7、TANT2基因全长，并运用实时荧光定量PCR(qPCR)技术催化，是保持细胞内能量代谢的关键成分j．在人类中检测其在各个组织及在低温胁迫下的表达情况．本研究可发现ANT蛋白有多种同型异构体。并且不同异构为拟穴青蟹低温生理研究提供科学资料．对其健康养殖体有着不同的染色体定位和组织表达模式．近年来以及分子育种也具有一定的指导意义．1材料与方法收稿日期：2Ol3一l203基金项目：福建省自然科学基金(2012J01147)；福建省科技计划重点项目(2oo8N()(14o)1．1实验动物*通信作者：haihuiye@xmu．edu．cn拟穴青蟹成体来源：购买于厦门市第八水产品市第3期于坤等：拟穴青

8、蟹ANT2基因的克隆与低温胁迫表达分析场，甲壳长度为7．2～8．8cm，体质量为200～350g，(NanoDrop2000)检测RNA的纯度及浓度．总RNA实验室暂养1d，水温为(28．0±0．5)。C．满足质量要求后，取2g总RNA，参照RevertAidTM拟穴青蟹第1期仔蟹的来源：从天然海区捕捞拟FirstStrandcDNASynthesisKit试剂说明书，进行反穴青蟹的大眼幼体，在实验室内(水温(28．0±