原代细胞培养 实验报告.doc

《原代细胞培养 实验报告.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、细胞生物学实验报告原代细胞培养1.实验目的：了解原理代细胞培养的基本方法，初步掌握无菌操作的方法。2.实验用品：（1）仪器及器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管、微量移液管、培养皿、离心机、注射器、L型针头（2）实验药品：蒸馏水、75%酒精溶液、PBS溶液、细胞培养液（3）实验材料：小鼠3.实验原理：（1）动物细胞培养：从动物体内取出体细胞，在体外模拟体内环境在无菌、适宜温度和一定的营养条件下，使之生存、生长、繁殖，并维持其结构和功能的方法。原代细胞培养：直接从体内获取细胞组织或器官进行体外培养至第一次传代培养为止。细胞培养至一定程度后，需再做培养。及培养的细胞分散后，

2、从一个容器以一定比例转移到另一容器扩大培养。代数：传代培养累计次数（2）细胞培养的条件①气体条件：有一定的O）（小于空气中浓度）和CO2（5%）②无菌环境：培养用品应高温灭菌，培养液应无菌处理，操作应在超净工作台无菌操作。③最适温度：36～37℃为最适温度，30～37℃细胞可进行代谢，4℃细胞可存活数天。④渗透压：一般为260～320mmol/l（人血浆一般为290mmol/l）⑤营养条件：含细胞生长必须的有机物，氨基酸、维生素、无机盐、辅助物等。培养基中不含生长因子，因此，必须在培养基中加入小牛血清。⑥最适pH：7.0～7.4（中和细胞代谢废物与酸性气体环境）（3）贴壁生长与不贴壁生长①贴壁

3、生长：来自于实体组织的细胞多贴壁生长。贴壁生长的细胞进行传代培养更换培养皿时有以下步骤：首先，应轻晃培养皿并弃去上清液（去除死细胞），再用胰蛋白酶处理（细胞成片收缩，变圆），倾斜培养皿，用滴管吸去多余酶液，然后用滴管吸取PBS溶液吹打细胞并离心，最后，加入新的培养液，按比例分入培养皿中。②不贴壁生长：造血细胞、癌细胞等。半量换液法：吸取1/2培养液到新的培养皿中，再离心，取下层细胞，分入多个培养皿中。4.实验步骤：（1）用断头法处死小鼠，置于解剖盘中。浸入75%的酒精溶液消毒3mins。取出转入超净工作台的解剖盘中。无菌操作打开腹腔，取出脾脏，去除周围的脂肪组织镊起脾脏用PBS液自上而下冲洗1

4、~2次。转入无菌培养皿中待用。（1）分离脾细胞，用滴管向上述无菌培养皿中滴入PBS液30滴。用L型针头注射器在皿中吸取PBS液0.2ml,延脾长轴方向注射入脾内（是脾脏膨胀以利于细胞散开）。用针尖在脾脏上扎孔。用L型针头轻轻刮出脾细胞，弃脾脏用滴管吹散刮出的细胞。（2）吸取上述分离的单个脾细胞悬液放入Eppendorf管中,使其为量1ml,以1000r/min离心5mins。（3）去塑料培养皿一个，用微量移液管（1ml）加入细胞培养液2ml。在盖上加标记待用。（4）用微量移液管（200µl）吸取塑料皿中的培养液400µl，加入步骤（3）离心后并弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹散并混

5、匀细胞然后吸取200µl接种于上述塑料培养皿中混匀，放入-37℃5%CO2的培养箱中培养。2.实验结果：细胞少部分正常生长，大部分死亡。3.分析与讨论（1）结果分析：脾细胞是高度分化的体细胞，功能上属于淋巴B细胞。成熟脾细胞在体内不进行分裂，同时由于其属于淋巴细胞，因而其寿命较短。因此，在此次体外培养实验，对其进行传代培养的意义不大，而其死亡率较高也比较正常。当然，操作不当也是细胞死亡率较大的一个主要原因，以后应养成良好的实验习惯。（2）注意事项①取脾脏细胞：脾细胞是红色的。取脾脏细胞时，应把脾刮至PBS溶液呈红色，同时，保证脾不掉碎屑。这样得到的细胞是比较大量同时也比较纯净的。②无菌操作：无

6、菌操作时，动作应迅速，否则会使培养皿中进入细菌，影响实验结果③无菌操作：在无菌操作台上操作时，应注意不可使袖口碰到工作台上的物品，以免污染④污染的预防：预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。只有预防工作做在前，才能将发生污染的可能性降到最小程度。一般预防可从以下几方面着手：从物品、用品消毒灭菌着手：细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在无菌试验阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。从操作者做起：（1）操作者责任心要强，要细心稳重，操作技术要熟练。进无菌室前要用肥皂洗手或用5%新洁尔灭浸泡5分钟，按规定穿隔离衣。进入后关好门，坐下来尽量少走动。工

7、作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。事先要严格检查器材、溶液和培养物，不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便使，以免造成大批污染。　（2）操作者动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼。操作时尽量不要谈话，若打喷嚏或咳嗽应转向背面。　（3）操作时要常更换吸管，切勿一根吸管做到底。一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕及时收拾，保持实验室清