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1、蛋白定量技术(-)双缩脉测定法1.原理蛋白质中的肽键有双缩腿反应，在碱性溶液中与二价铜离子形成蓝紫色的络合物，在一定的范围内，颜色的深浅与蛋白质的含量成正比。此法特异性强,游离的氨基酸、小肽和核酸均不产生这种反应，但此法不够敏感，仅能测出亳克水平。2.试剂配制硫酸铜(CuS04•5H20)1.50g酒石酸钾钠5.00gH20500.0ml10%氢氧化钠(不含硫酸钠)300nilH20加至1000ml此溶液可长期保存，如产生暗红色沉淀，则应废弃重配。3.标准曲线的制备⑴准确称取牛血清白蛋白1.0g(必要时须首先采用凯氏
2、定氮法测定牛血清白蛋白制品中实际纯蛋白含量，然后换算)，以生理盐水配成1%的浓度。⑵将1%的牛血清白蛋白按表8T进行稀释：表8-1牛血清白蛋白稀释方法表成分试管号12345678910111%蛋白液(ml)1.0.090.80.70.60.50.40.30.20.1—蛋白含量(mg)109187654321—生理盐水(ml)0.50.60.70.80.91.01.11.21.31.41.5双缩月尿试剂(ml)4.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.0试剂蛋白含量(mg)8.07.26.45.6
3、4.84.03.22.41.60.80注：1%牛血清白蛋白，经凯氏定氮测定含纯蛋白为80%。⑶混匀后于室温放置0.5h〜lh,光电比色(540nm),顺序由低浓度至高浓度,每管测3次，求其平均值。⑷以0D值为纵坐标，蛋白含量为横坐标绘制标准曲线。4.样品测定⑴取样品0.1ml,加生理盐水1.4ml0也可将样品做1：10稀释加1ml,再加生理盐水0.5mlo（2）加双缩腿试剂4.0ml,混匀，至室温0.5h~lho⑶另以1.5ml生理盐水加4.0ml双缩腿试剂作为空白对•照。（4）测0D汹值。⑸根据0D值从标准曲线上查
4、出蛋白含量。注意：各种双缩服试剂的配法、加量及室温静置时间均有差异，一旦标准曲线制定后，样品的测定则必须与标准曲线制定的条件一致，否则结果有差异。（二）紫外光谱吸收法1.原理本法根据蛋白之中的芳香族氨基酸一色氨酸、酪氨峻在紫外光区的吸收特点而建立的。蛋白质在280nm波长附近有一吸收峰，其吸收程度与这些氨基峻的含量成正比。此法灵敏度高，可测到微克水平，操作简单，不需要加各种试剂,测完后，样品可回收。1.标准曲线的制备⑴用精密天平称取牛血清白蛋白50mg,溶于50ml生理盐水中。⑵以生理盐水再稀释成每ml含0.lmg>
5、0.2mg>0.3mg>0.4mg0.9mg,以盐水对照。⑶测各管0D细值。⑷以0D刎值为纵坐标，蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。2.样品测定将待测样品以盐水适当稀释，在0.10mg/mri.OOmg/ml之间，以生理盐水为对照,测0D颂值，从标准曲线上查出蛋白含量。（三）Folin酚法1.原理蛋白质中的酪氨酸与色氨酸和Folin酚试剂中的磷鸨酸、磷钥酸作用后,在碱性条件下不稳定，被还原成蓝色的化合物（钥蓝）。因此通过比色即可测知标本中的蛋白含量。该法的优点是操作简单、灵敏度高，且不受溶液中脂多糖的干扰。2.试剂试剂
6、甲：A液：Na2C0310.00gNaOH2.00g酒石酸钾钠（或钾盐钠盐）0.25g混合、溶于500ml蒸馄水中。B液:CuSO4.5H200.5gH20100.00ml用前将A液50份与B液1份混合即为试剂甲。试剂乙：于磨口回流瓶加入下列试剂Na2WO4•2&0100.00gNaMo04•2H2025.00gH20700.00ml85%H3P0450.00ml浓HC1100.00ml按上回流冷凝管以小火回流10h后再加：硫酸锂150.00g凡050.00ml浪水数滴开口继续沸腾15min,驱除过量的浪，冷却后溶液
7、呈黄色微带绿色（如仍呈绿色,须重复滴加液体浪步骤）。稀释至1L,过滤，滤液置于棕色瓶保存。使用时用标准NaOH液滴定，以酚猷为指示剂，然后适当稀释（加水约1倍）使最终浓度为lmol/Lo3.标准曲线的制备(1)取标准牛血清白蛋白2.50mg，溶于10ml蒸儒水中，使成250ug/mlo(1)按表8-2稀释。表8-2标准曲线稀释方法成分试管号1234567891011牛血清白蛋白标准品(ml)00.20.20.40.10.60.60.80.81.01.0生理盐水(ml)1.00.80.80.60.60.40.40.20
8、.200蛋白含量(ug/ml)05050100100150150200200250250(3)每管加试剂甲5ml,混合后室温放置lOmin,再加0.50ml试剂乙(即Folin酚试剂)，立即摇匀(否则显色降低)。⑷30min后测0D顷nm。⑸以0D为纵坐标，蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。1.样品测定(1)待测样品hnl(适当稀释至约含25yg
