细胞蛋白提取及定量.doc

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1、一、蛋白获取----cell裂解（冰浴操作）试剂：①RIPA---cell裂解液②蛋白酶抑制剂100×PMSF;50×Cooktail③4×loading④待裂解cell在冰上冻融，试剂配制裂解液RIPA100μln00μl100×PMSF1μl×n=nμl50×Cooktail2μl2nμl步骤：①去除6孔板培养基，PBS洗2遍②将配制好的裂解液按照100μl/well（根据细胞量来确定需要加裂解液量）混合后加入6孔板（60mm为300μl），冰上裂解30min。③用细胞刮将将裂解后的cell和裂解液混合液刮净，并转

2、移到1.5ml离心管中，以15000rpm/30min/4℃离心，收上清④取2μl用于测量蛋白浓度，其他用作westernblottiing⑤BCA法测蛋白浓度a)取上清2μl稀释25倍（2μl上清+48μlH2O）置于新EP管中b)配制标准品c)配制工作液(#standards+#unknowns)×(#replicates)×(volumeofWRpersample)=totalvolumeWRrequired；only200μLofWRreagentisrequiredforeachsampleinthemicr

3、oplateprocedure按25μl/well将标准品和待测蛋白样加至96孔板中（(workingrange=20-2000μg/mL)Ifsamplesizeislimited,10μLofeachunknownsampleandstandardcanbeused(sampletoWRratio=1:20).However,theworkingrangeoftheassayinthiscasewillbelimitedto125-2000μg/mL.）a)按200μl/well将工作液加入各孔中，并在plates

4、haker混匀30sb)37℃/30min孵育c)冷却至室温d)酶标仪测定562nm吸光度e)绘制标准曲线并根据曲线算出各蛋白样的浓度f)拿出测定分析数据，算出30μg蛋白所需的体积③蛋白样处理按照4:1的比例在蛋白样中加入loadingbuffer，混匀后100℃煮10min，冷却后放置-80℃保存。(为避免反复冻融使蛋白变性，可以按照测定浓度计算每次上样量，分装蛋白样。)④Westernbloting1、配胶：分离胶每块5mL，先安装好后加点水看是否漏，不漏则将配好的分离胶加入，上层加、满水或异丙醇赶出气泡(水要来

5、回加，避免胶一侧偏低)2、约30min后胶凝固（有分界线），将水吸出，配好浓缩胶加满，不要产生气泡，插梳子3、30-60min浓缩胶凝固后，将玻璃板拿出置于电泳架子上固定（为避免跑胶时看不清分界线，可以在架子上标出分界线所在位置），中间加满1*SDS，拔出梳子，上蛋白样品，两头为marker，大约5μL（小的用3，大的用2）4、置于电泳槽中，外面加回收的电泳液至刻度线处5、80v电泳至条带跑到分界线处，120v电泳至溴酚蓝跑出，取出架子，倒掉电泳液。6、转膜液750mLddH2O，150mL无水甲醇，100mL10*转

6、膜液，将分离胶在上样处或另一端切下一小口作为标记，同样的方向膜上也剪下一小口(膜要先放在转膜液里平衡15min,PVDF膜还需要无水甲醇活化)7、将胶铺在膜上，上面垫上海绵等，赶出气泡，置于电泳槽，黑对黑，100v，70min转膜8、剪下条带所在位置（保持膜湿润PBST）置于槽中，PBST洗3遍，加入3%BSA封闭1h（或者4℃过夜）9、一抗用3%BSA(或者是PBST)稀释后（1：n000）加入，4℃过夜10、回收一抗，PBST洗3遍，每次5min，PBST稀释二抗（抗的是种属而不是某一种蛋白，HRPRabbit1:

7、3000；HRPMouse1:5000）11、加二抗，摇床慢摇，孵育1h12、洗三次，配显影液1:1，每槽200μL的量13、上机曝光