老年乳腺癌MGMT、GSTπ、HIF1α表达与临床预后关系的组织芯片研究.doc

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1、老年乳腺癌mgmt、GST兀、HIF1a表达与临床预后关系的组织芯片研究作者：张剑虹张飞张凡张九鸿刘军超林媛媛赵秀芳’【摘要】目的探讨老年乳腺癌06甲基鸟喋吟0NA甲基转移酶(MGMT)、谷胱甘胱S转移酶(GSTn)、缺氧诱导因子1(HTF1a)表达与临床预后之间的关系。方法应用组织芯片技术和免疫组织化学方法检测老年乳腺癌34例MGMT、GST兀、HIF1a的表达，并与临床预后资料进行分析。结果MGMT、GSTn.HTFla的阳性表达率分别为47%(16/34)、58%(19/34)、64%(22/34)；MGMT阳性表达与组织学类型、TNM分期密切相关(PV

2、0.05),与肿瘤体积、淋巴结转移无关(P>0.05)；GST兀阳性表达与TNM分期、淋巴结转移密切相关，与组织学类型、肿瘤体积无关(P>0.05)；HIFla阳性表达与组织学类型、肿瘤体积密切相关，与TNM分期、淋巴结转移无关(P>0.05)o经多因素cox比例风险模型分析显示：TNM分期、肿瘤组织类型及MGMT、HIF1a阳性表达与乳腺癌患者术后生存率有关(P<0.05)o结论TNM分期、肿瘤组织类型及MGMT、HTFla可作为老年乳腺癌的独立预后指标。【关键词】乳腺癌；MGMT；HIFla；组织芯片1放疗科第一作者：张剑虹（1972）,女，主治医师，主要

3、从事肿瘤病理研究。乳腺癌已成为危害女性的常见肿瘤，化疗成为术后治疗老年乳腺癌的主要手段，但肿瘤耐药的存在导致治疗效果和预后差别悬殊。MGMT是一种重要的DNA错配修复基因，对烷化剂介导的DNA损伤具有极强的修复作用，与肿瘤耐药密切相关（1）;GST兀是一种乳腺特异性耐药基因，在包括乳腺癌、大肠癌，白血病等多种肿瘤中存在高表达〔2）；HIFlei在多种肿瘤中存在表达，与肿瘤细胞适应缺氧、能量代谢、肿瘤血管生成及增殖转移过程密切相关（3,4）。本实验选取上述三个指标并利用组织芯片技术在一组老年乳腺癌患者中进行检测，并与预后资料进行综合统计分析，进一步探讨老年乳腺癌

4、耐药的分子机制。1材料与方法1.1临床病理资料收集河北北方学院附属第•医院1988年1月〜1998年12月住院患者中临床病理资料及预后资料齐全的乳腺癌34例，年龄58〜69（平均63±4.5）岁。组织学类型：浸润型导管癌18例，浸润小叶癌9例，分泌型癌3例，小管癌4例；高分化癌20例，低分化癌14例。淋巴结转移23例，未见淋巴结转移11例。肿瘤直径大于4cm的20例，小于4cm的14例。TNM分期I、II期21例,III、IV期13例。所有病例手术前未接受放化疗，手术治疗和术后化疗,患者最长生存时间81个月，最短存活15个月，平均生存37.3个月，死亡原因均为

5、肿瘤相关性疾病。1.2组织芯片制作组织芯片委托试剂公司在天津肿瘤医院肿瘤研究所完成，过程如下：组织载玻片经过夜泡酸、充分清洗并烘干，用多聚赖氨酸行防脱片处理，对每一组织标本，观察HE切片，选取目标组织并在HE切片及其相应石蜡组织块（供体蜡块）上标记，莱卡石蜡空白蜡块（受体蜡块）与蜂蜡混合（比例为1：1）,W2.2cmX3.5cmXIcm大小蜡块，用加拿大生产CDX718组织芯片仪打孔制成带孔空白蜡块，将蜡块放在39C〜42°C水浴中软化后，用组织芯片仪从供体蜡块标记部位逐个取出直径1mni高4mm的组织柱，推入空白蜡块预先设计的相应孔内，这样在空白蜡块上制作完

6、成了68个组织芯片，为防止染色过程中脱片，每例标本上样四个点，分别安插在空白蜡块1和2中，对蜡块进行连续切片，裱于防脱片处理的载玻片上。1.3试剂石蜡包埋,4uni连续切片oMGMT.GST兀一抗试剂均购自北京中山试剂公司。HTFla购自福建迈新试剂公司，GENE公司生产进口分装，克隆号g459823p76o1.4免疫组织化学染色主要免疫组化步骤：二甲苯脱蜡、梯度酒精至水，3%双氧水灭活内源性过氧化酶，PBS缓冲液振洗，（采用专用微波炉进行抗原微波热修复），正常山羊血清封闭、一抗冰箱过夜,二抗、三抗各1h,DAB显色10〜15min,复染核脱水透明，中性树胶封

7、片。结果判断:着色细胞＜10%为阴性，＞10%为阳性。MGMT、GST兀、HIF1a阳性部位定位在肿瘤细胞质。采用HIPAS100图像分析软件对所有切片进行图象分析，每张切片随机选取10个着色典型区域旦不重复的视场，放大400倍镜下测量每个视场中阳性灰度单位，取其均数即为该切片的着色强度（即表达水平）。1.5统计学方法应用SPSS10.0统计软件进行分析。组间表达率的比较采用Fisher精确概率法，各指标在同一组间的表达水平以及与浸润程度之间作直线回归相关分析。2结果2.1MGMT＞GST兀、HIFla在老年乳腺癌的阳性率比较MGMT的阳性表达率为47%,低分

8、化癌明显高于中高分化癌、TNMIH、I