资源描述：
《糖化酶固定化实验报告.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、糖化酶固定化实验报告学号：080500130姓名：黄兆峰专业：其他组员：黄志成、李盟、苏温培指导老师：朱秋享实验时间：2008.11.5—2008.11.7、目的要求本实验为酶工程综合实验，由学生自行设计实验方案，培养学生独立实验的能力；并掌握酶活测定方法，米氏常数测定，学习固定化酶的常用方法及固定化酶的表征。二、基本原理游离酶可通过各种固定化方法，增加其稳定性并且有利于连续化生产和重复使用。酶固定化后可用各种理化性质的变化来表征其效果。酶活测定原理：糖化酶（即淀粉a-1,4.葡萄糖昔酶）有催化淀粉水解的作用，从淀粉分子非还原性末端开始，分解a-1，4.葡萄糖昔键生成葡
2、萄糖，反应生成的葡萄糖用次碘酸钾法定量测定，以表示糖化性淀粉酶的活力。本次固定化酶使用的方法是包埋法，将酶、细胞或原生质体包埋在各种多孔载体中，使其固定化的方法成为包埋法。包埋法制备固定化酶、固定化细胞或固定化原生质体时，根据载体材料和方法的不同，可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两大类。以各种多孔凝胶为载体，将酶、细胞或原生质体包埋在凝胶的微孔内的固定化方法为凝胶包埋法。本次实验中具体使用的方法为海藻酸钙凝胶包埋法。三、实验仪器及材料1、实验用乳化机WL500CY、注射用筒50mL6号针头、冰箱、其他实验常用玻璃仪器2、糖化酶、海藻酸钠、明胶四、试剂配方1、2%可溶性淀粉
3、称取可溶性淀粉碎2g（预先100笆烘干约2h至恒重），用少量蒸馅水调匀，徐徐倾入己沸的蒸馅水中，煮沸至透明，冷却定容至100ml,此溶液需当天配制。2、lmol/LpH4.5醋酸钠缓冲液取无水醋酸钠8.024g,先在少量水中溶解，定容至lOOOmlo取分析纯冰醋酸5.78ml定容至1000mlo以上两种溶液按醋酸和醋酸钠的体积比为25：22混合即为所要求的缓冲液。3、0.05mol/L碘液：称取25克碘化钾溶于少量水中，加入12.7克碘，溶解后定容至1000毫升贮存于棕色瓶中。4、0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取分析纯氢氧化钠4克溶解并定容至1000毫升。5、1mol
4、/L硫酸:吸取分析纯浓硫酸（比重1.84）55.5毫升，缓缓如入944.5毫升水定容至1000毫升。6、0.1mol/L硫代硫酸钠:称取26克硫代硫酸钠和0.4克碳酸钠，用煮沸冷却的蒸馅水溶解并定容至1000毫升，配制后放置三天再标定。五、实验步骤1、酶活测定⑴操作步骤取2%可溶性淀粉溶液25毫升加pH4.5醋酸缓冲液5毫升混匀于比色管，在40°C恒温水浴中预热5-10分钟加入待测酶液2毫升（空白以蒸馅水代替酶液）准确计时1小时。取出加入4滴20%NaOH终止酶反应,冷却至室温。取上述反应液5毫升于定容瓶中，先加入0.05mol/L碘液10毫升，再加0.1mol/LNa
5、OH10毫升，摇匀暗处静置15分钟。加入2N硫酸2毫升。用0.1mol/L硫代硫酸钠滴定至无色。其与空白消耗硫代硫酸钠毫升数的差值应在4~6之间，否则要适当调整酶液的稀释倍数。⑵计算酶活(mg/ml)=(A-B)*N*90.05*Vl/V2/V3*2A一空白所消耗的Na2S2O3的毫升数;B—样品所消耗的Na2S2O3的毫升数;90.05—1毫升1N的Na2S2O3相当的葡萄糖毫克数;VI—反应液总体积（32.20毫升）;V2—吸取反应液样品体积（5毫升）;V3.吸取酶液毫升数（2毫升）；2—反应30min,换算成lh的酶活力系数所得的结果表示至整数;N—Na2S2O3
6、的当量浓度（O.lmol/L）。2、米氏常数的测定取lml游离酶,分别以0.20%,0.30%,0.40%,0.50%,1.00%,2.00%浓度的可溶性溶液为底物，在40°C下反应lOmin,采用以上的方法测定游离酶活,做Lineweaver-Burk双倒数曲线图,即以1/[S]为横作标,以1/v（反应初速度）为纵坐标。其斜率即为米氏常数。3、糖化酶的固定化将酶液15ml游离酶与3%的海藻酸钠150ml混合，然后加入3%的明胶溶液150ml混合乳化约lOmin,调pH为4,慢速搅拌并降温至5〜10°C,通过6号注射针头将上述冷却液以5cm的高度注进1%氯化钙溶液中，立
7、刻形成光滑的微球，然后保持温度为4°C,球在氯化钙溶液中被硬化30min,固定化酶被贮存在0〜5°C冰箱。4、固定化酶的酶活测定⑴操作步骤取2%可溶性淀粉溶液25毫升加pH4.5醋酸缓冲液5毫升混匀于比色管，在40°C恒温水浴中预热5-10分钟加入固定化酶5g（空白以蒸馅水代替固定化酶）准确计时1小时。取出过滤终止酶反应，冷却至室温。取上述反应液5毫升于定容瓶中，先加入0.05mol/L碘液10毫升，再加0.1mol/LNaOH10毫升，摇匀暗处静置15分钟。加入2N硫酸2毫升。用O.lmol/L硫代硫酸钠滴定至无色。⑵计算酶活(mg/m
