糖化酶的固定实验

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1、糖化酶的固定化实验一、实验目的本实验为酶工程综合实验。由教师给定题目，学生通过查阅文献，并结合所学知识自行设计实验方案，列出所需试剂和材料及仪器等，然后在教师知道下根据自己设计的实验方案进行实验；从而培养学生独立实验的能力；并掌握酶活测定方法，米氏常数测定，学习固定化酶的常用方法及固定化酶的表征。二、实验原理糖化酶是一种用途广泛的酶，粮食工业、食品工业、发酵工业都经常使用。随着生物技术的迅速发展,糖化酶的生产和使用水平也有了进一步的提高。固定化技术是近年来迅速发展的一种崭新技术，固定化酶同游离酶相比有很多优点,它开辟了酶的许多

2、新用途。游离酶可通过各种固定化方法，增加其稳定性并且有利于连续化生产和重复使用。酶固定化后可用各种理化性质的变化来表征其效果。糖化酶活力的测定采用次碘酸钠法。糖化酶能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1,4葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，由此可计算酶活力。次碘酸钠法的原理为在碱性介质（NaOH）中，碘歧化为次碘酸钠和碘化钠，次碘酸钠氧化溶液中游离的醛基为酸基。适当酸化，剩余的次碘酸钠与碘酸钠又生成碘，以淀粉为指示剂，用硫代硫酸钠标准溶液滴定

3、。根据总碘量和硫代硫酸钠的用量，可对应获得甲醛的量。反应为：I2+2OH-=OI-+I-+H2OHCHO+OI-+OH-=HCOO-+I-+H2OOI-+I-+2H+=I2+H2OI2+2S2O32-=S4O62-+2I-米氏常数Km为当酶促反应速度是最大反应速度一半时的底物浓度。将米氏方程，两边取倒数得公式：，此式即为Lineweaver-Burk方程，这一线性方程，用对作图即得一条直线，直线的斜率为Km/Vmax，1/v的截距为1/Vmax。当1/v=0时，1/〔S〕的截距为-1/Km。即根据直线在横轴上的截距(-1/Km

4、)可求出米氏常数Km。糖化酶固定化机理：海藻酸钠是糖醛酸的钠盐聚合物在酸性条件下可形成凝胶,明胶是一种多肽聚合物,在一定pH条件下,带正电荷的明胶与海藻酸根阴离子形成聚合物,同时海藻酸钠与钙离子在一定条件下结合形成不溶于水的微球从水中分离出来。戊二醛含有二个醛基,可与蛋白质中的氨基、酚基、巯基发生Schiff反应,相互交联而使固定化酶硬化,由于正电荷的明胶与海藻酸根阴离子形成聚合物已将绝大部分游离酶包埋起来,因此这种交联主要发生在明胶与戊二醛之间,实验也证明这种交联对酶活力的损失并不大,但却能达到使固定化酶的使用时间延长、机械

5、强度增大、稳定性提高的效果。三、实验试剂与仪器1.实验试剂A2%可溶性淀粉：称取绝干可溶性淀粉2g，以少许蒸馏水调匀，倾入80mL左右的沸水中，继续煮沸至透明状。冷却至室温后，加蒸馏水定容至100mL。BpH4.6，0.1mol/L醋酸缓冲液：用0.1mol/L的醋酸溶液与0.1mol/L的醋酸钠溶液等体积混合。C0.1mol/L碘液：称取碘化钾36g，溶于100mL蒸馏水中，加入碘12.7g，溶解后定容至1000mL。D0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4gNaOH，用水溶解后，定容至1000mL。E1mol/L硫酸溶液：量

6、取56mL浓硫酸（相对密度1.84），换换倒入适量水中，定容至1000mL。F0.025mol/L硫代硫酸钠溶液：称取硫代硫酸钠（Na2S2O3`5H2O)6.25g，碳酸钠0.05g，溶于1000mL煮沸后冷却的蒸馏水中，存于棕色瓶内。G0.5%淀粉指示剂：称取0.5g可溶性淀粉，用少许水调匀，倾入80mL沸水中，继续煮至透明，冷却后定容至100mL。2.实验仪器A实验用乳化机，注射用筒20mL，6号针头，冰箱。B试管，烧杯，容量瓶，玻璃棒，温度计，三角瓶，水浴锅，分光光度计，天平，干燥箱，生化培养箱。四、实验方案1.酶活测

7、定次碘酸钠法：按文献定义，在pH4.6，温度40℃的情况下每小时催化可溶性淀粉水解生成1mg葡萄糖的酶量为一个酶活力单位。A吸取2%可溶性淀粉10mL，加入pH4.6醋酸缓冲液5mL，混匀后于40℃水浴中预热10min。B加入酶液1mL（空白实验以煮沸失活的酶液代替），于40℃水浴中反应10min。反应结束时，立即于沸水浴中加热使酶失活。C取上述反应液5mL于碘量瓶，加入0.1mol/L碘液5mL及0.1mol/L氢氧化钠5mL，摇匀，在暗处放置15min，加入2mol/L硫酸溶液2mL。D以0.5%可溶性淀粉为指示剂，用0.

8、1mol/L硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终点。记录0.1mol/L硫代硫酸钠消耗的毫升数A以及空白滴定所消耗的硫代硫酸钠的毫升数B。E计算酶活力。在上述条件下每小时催化可溶性淀粉生成1mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位，即：酶活力=（B-A)×N×90.05×16/5×6