甲基纤维素造血干祖细胞半固体培养基说明书.doc

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1、甲基纤维素人造血干/祖细胞半固体培养基说明书StemCultHU663英文名称：HumanMethylcelluloseCompleteMediumContainingCytokines货号：0663产品规格：100ml/瓶产品成份：1％甲基纤维素、IMDM、FBS、BSA、L－Glutamine，2-ME、rhSCF、rhIL-3、rhGM-CSF。保存运输：－20℃，保存2年；4℃，保存1个月。造血干/祖细胞在体外适宜的培养条件下，可向红细胞系、粒细胞系、巨核细胞系分化。本产品为造血干/祖细胞体外生长和分化提供了最合适的培养基和半固体支持物，适合粒/巨噬细胞系集落

2、（CFU-GM、CFU-G、CFU-M）的生长。用途：定量分析研究人骨髓、动员外周血、脐带血、淋巴细胞分离液分离的细胞产物、及CD34＋中的造血干/祖细胞；定量分析研究提取或冷冻保存中的干细胞的质量；体外扩增的造血干/祖细胞定量检测研究；定量分析研究长期培养起始细胞；研究分析造血功能异常病人造血干/祖细胞的造血能力。一、分装：1、将－20℃保存的StemCult放置于4℃冰箱过夜溶化（或者于室温中溶化）。2、强烈震荡1－2分钟，充分混匀。3、静置30分钟，去除气泡。4、用吸管（注意甲基纤维素粘稠，应选用粗口径，以免吸取困难）吸取StemCult，分装于10ml试管中，

3、保存于－20℃冰箱，可长期使用。二、实验操作方法：Ficoll-Paque法提取有核细胞1、取骨髓、脐带血，ACD或肝素抗凝，IMDM完全培养液（IMDM加10%新生牛血清）加倍稀释。2、取10ml试管，加淋巴细胞分离液（Ficoll-Paque比重1.077）3ml。3、将经加倍稀释的骨髓或脐带血小心加入淋巴细胞分离液的液面上，注意不要破坏界面。4、离心2000rpm/分，20分钟，细胞分层，下层为红细胞，中间层是白膜，富含白细胞，上层是血清。5、用细长玻璃吸管，小心吸取白膜层（注意不要破坏白膜层），放置于另外一支10ml试管中。6、加入8mlIMDM完全培养液，离

4、心，1000rpm/分，10分钟，洗涤，细胞沉淀于试管底部。7、弃去上清，于沉淀的细胞中再加入8mlIMDM完全培养液，1000rpm/分，10分钟，洗涤。1、弃去上清，于沉淀的细胞中加入1mlIMDM完全培养液，混匀。羟乙基淀粉沉淀法提取有核细胞1、取骨髓、脐带血，ACD或肝素抗凝。2、按照体积1：4（脐带血：HES）加羟乙基淀粉（Hespan）3、4℃冰箱放置30分钟，细胞分2层，下层红色是红细胞，上层黄色血浆含有核细胞。4、取上层血浆，加入8mlIMDM完全培养液，离心，1000rpm/分，10分钟，洗涤，细胞沉淀于试管底部。5、弃去上清，于沉淀的细胞中再加入8

5、mlIMDM完全培养液，1000rpm/分，10分钟，洗涤。6、弃去上清，于沉淀的细胞中加入1mlIMDM完全培养液，混匀。细胞培养分析1、取混匀的细胞悬液50ul，细胞计数，用完全培养液调整细胞浓度至2×106ml。2、取100ul细胞悬液，共计2×105细胞，加入预先加入StemCult1ml的试管中（注：由于甲基纤维素有粘性，用微量加样器吸取StemCult会粘附到枪头上，需取1.4ml加入试管中，最后样本量大约是1ml），充分混匀。3、取充分混匀含有细胞的StemCult，放置于35mm培养皿中，（或6孔板、或24孔板）中，置于37℃，5％的CO2培养箱中，1

6、4天，倒置显微镜下，观察结果。推荐培养细胞浓度细胞来源细胞浓度（每1.1ml）骨髓（氯化铵处理）1×105骨髓（密度梯度离心）1－5×104脐带血（密度梯度离心）1×105普通外周血（密度梯度离心）2×105动员外周血0.1－1×105CD34＋细胞（骨髓、脐带血、动员外周血）1－5×103集落计数：CFU-GM：培养10－12天，观察大于40或50的细胞团为集落。其形态分3种，a.致密型：细胞紧密成团，细胞个体较小，是以粒细胞为主。b.混合型：细胞团中央为聚集的粒细胞，周围弥散分布单核细胞或巨噬细胞。C.疏散型;细胞团比较均匀分散，细胞个体较大，多由单核巨噬细胞组成

7、。仅供实验室研究使用