外源性硫化氢对肝癌细胞系HepG2自噬的影响.pdf

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1、20l5年2月首都医科大学学报Feb．2015第36卷第1期JournalofCapitalMedicalUniversityVo1．36No．1[doi：10．3969／j．issn．1006-7795．2015．01．022]·基础研究·外源性硫化氢对肝癌细胞系HepG2自噬的影响陈宁王珊珊陈玉涵殷继明陈德喜丁惠国(1．首都医科大学附属北京佑安医院肝病消化中心，北京100069；2．北京市肝病研究所，北京100069)【摘要】目的探讨外源性硫化氢(hydrogensulfide，HS)对肝癌细胞系HepG2细胞自噬的影响及其机制。方法应用外源性HS供体——硫

2、氢化钠(sodiumhydrosulfide，NariS)处理HepG2细胞，采用Westernblotting方法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3一Ⅱ(mierotubule-associatedlightchain3-11，LC3-1)表达变化，Real—timePCR方法检测自噬相关基因beclinl和atg5的mRNA表达浓度，免疫荧光方法观察HepG2细胞自噬颗粒变化、凋亡相关蛋白M30及凋亡小体变化，AnnexinV／PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果瞬时转染绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)一LC3质粒

3、后，发现NaHS处理组HepG2细胞内GFP—LC3Ⅱ绿色荧光斑点明显增加，M30阳性细胞率[(8．37±1．03)％]，与对照组[(2．14±0．69)％]比较差异有统计学意义(尸<0．05)；同时，高倍镜下观察结果显示，NaHS处理后细胞核异染色质明显增加，凋亡小体形成。AnnexinV—FITC／PI双染结果显示NaHS处理组细胞凋亡率高于对照组[(16．32±0．28)％vs(0．67±0．09)％]，差异有统计学意义(P<0．05)。Real—timePCR显示NaHS可增加HepG2细胞beclinl和atg5mRNA表达水平，LC3．II表达明显增

4、加。且自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)可降低NaHS所致的beclinl和ng5的mRNA表达。结论外源性硫化氢能够上调自噬相关基因beclinl和atg5表达，进而促进HepG2细胞发生自噬，并诱导细胞凋亡。【关键词】硫化氢；自噬；自噬蛋白微管相关蛋白轻链3一Ⅱ；凋亡【中图分类号】R969．9EfectsofexogenoushydrogensulfideonautophagyofHepG2cellsChenNing，WangShanshan，ChenYuhan，YinJiming，ChenDexi，DingHuigu

5、o(1．DepartmentofGastroenterologyandHepatology，BeijingYou’alzHospital，CapitalMedwdUniversity，Beijing100069，China；2．BeijingInstituteofHepatology，Beijing100069，China)【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectsofexogenoushydrogensulfide(H2s)ontheautophagyofHepG2cellsanditsunderlyingmechan

6、ism．MethodsHepG2celswereadministratedbysodiumhydrostdfide(NaHS)，adonorofH2S，for24h，theexpressionofautophagy—relatedproteinLC3-ⅡwasdetectedviaWesternblotting；ThemRNAlevelofautophagyrelatedgenebeclinlandmweredetectedviaRT—PCR。Theautophagyparticlesandapoptosiswereobservedusingirmnunoflu

7、orescence．AnnexinV／PIflowcytom曲咿wereperformedtoassesstheeffectofNariSoncellapoptosis．ResultsNaHSenhancedtheautophagy—relatedprotein(LC3-1I)expressionandbeclinlmRNA，哦mRNAandautophagosomeformationcomparedwithcontro1．3-MAcouldinhibitNaHS—inducedautophagy．ImmunofluorescenceshowedtheM30po

8、sitivecellsw