特异性过敏原TBt多克隆抗体的制备与鉴定.pdf

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1、1000ISSN1007—8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmuno1)2011，27(9·论著·文章编号：1007—8738(2011)09—1000—03特异性过敏原TBt多克隆抗体的制备与鉴定杨振煌，崔晓东，李平，李玉英，王转花(山西大学生物技术研究所化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西太原030006)[摘要]目的：制备特异性苦养主要过敏原TBt的多克隆抗性作用。为了深入了解苦荞过敏原的致敏机制，体，为深入研究TBt分子中各结构域的功能奠定基础。方法：揭示其结构与功能的关系，本研究

2、采用天然苦荞过通过盐析，离子交换层析，分子筛层析等方法从苦养种子中敏原免疫动物，以获得一种特异性的多克隆抗体，并纯化出过敏蛋白TBt，免疫新西兰兔子，制备多克隆抗体。用鉴定其对荞麦过敏患者血清IgE的抑制作用，为下间接ELISA、Westernblot检测该抗体的效价和特异性；竞争一步研究该蛋白的分子特征及免疫治疗奠定基础。ELISA研究IgG抗体对TBt过敏患者血清IgE的抑制作用。结果：间接ELISA法检测所制备抗体的效价达1：256000左1材料和方法右；Westernblot显示该抗体能与TBt蛋白特异结合；竞

3、争1．1材料健康雄性新西兰白兔购于山西省农科院畜牧研ELISA表明制备的IgG抗体能够特异性抑制养麦过敏患者血究所。底物．邻苯二胺溶液、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂清IgE与过敏蛋白的结合。结论：制备的TBt多抗血清具有为Sigma公司产品。辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgE购于较高的效价和良好的特异性，该多克隆抗体可用于TBt的免Southembioteeh公司。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IsG购疫活性鉴定，为下一步研究该蛋白的分子特征及免疫治疗奠于索莱宝生物公司。硝酸纤维素膜为Sehleicher&SehueH公定了

4、基础。司产品。DAB显色试剂购自武汉博士德生物公司。ELISA96[关键词]苦荞；过敏蛋白；多克隆抗体孔板为Coster公司产品。对养麦过敏患者血清和正常血清均[中图分类号]R392．11[文献标识码】B为自愿者提供。ResourceQ离子交换层析柱(1mL)，Super-dex7510／300GL层析柱和AKTAExplorer蛋白质纯化系统购过敏反应是人类常见自身免疫性疾病，症状复自GEHeahheare。杂，危害广泛而且难以根治。随着社会文明的进步1．2方法和人们生活方式特别是饮食结构的改变，各种过敏1．2．1过

5、敏蛋白TBt的提取和纯化根据本室之前建立的性疾病层出不穷，且发病率逐渐增高，据统计，全球方法制备天然过敏蛋白TBt。通过盐析，离子交换层析，分约有30％～40％的人患有过敏性疾病⋯。可以引起子筛层析等步骤从苦荞种子中纯化得到苦荞主要过敏原TBt，过敏反应的过敏原有很多种，其中食物过敏占有相经SDS．PAGE电泳检测(图1)，目的蛋白TBt纯度较高，可用于特异性抗体的制备。当大的比例。一般食物中使机体产生过敏的并与IgE等抗体结合的都为蛋白质或糖蛋白，相对分子质量()约10000～70000。养麦属双子叶蓼科植物，具有很

6、高的营养价值和药用价值，是一种理想的具有保健功能的杂粮作物。然而有研究表明，部分人在接触或食用荞麦食品后会产生哮喘、皮症等过敏症状，并且对其表位的研究也有报道。本实验室先前从苦荞麦种子中分离纯化获得了约为58000的主要过敏蛋白TBt，并采用基因克图1TBt经凝胶过滤层析纯化后的SDS-PAGE分析隆方法获得了其C一端及N一端基因序列，先后在Gen-1：中分子量标准蛋白；2：纯化后的TBt非还原性上样(未加B一巯基Bank登录J。免疫活性分析显示，天然和重组型苦乙醇)；3：纯化后的TBt还原性上样(含有B一巯基乙醇)．

7、荞过敏原能与荞麦过敏患者血清中的IgE发生特异1．2．2TBt多克隆抗体的制备将纯化的TBt蛋白，按0．5ms／kg，背部皮下多点注射免疫四只新西兰白兔，注射抗原前收稿日期：2010—1l一04；接受日期：2010—12—10基金项目：国家自然科学基金资助项目(30970616)；山西省科技攻关耳静脉取血作为免疫前的阴性对照。免疫周期为0d、14d、24d、34d。第1次免疫加弗氏完全佐剂乳化，其余3次加弗资助项目(20100321101)作者简介：杨振煌(1987一)，男，山西忻州人，硕士生氏不完全佐剂乳化。每次免疫

8、1周后，耳静脉取血检测抗体Correspondingauthor．Tel：035l-7019371，E·mail：zhwang效价，第4次免疫2周后，经心脏采血(麻醉剂浓度2％，采@SXU．edu．cn取腹腔注射)，将收集的血液37~C放置lh，凝固后4℃过夜，ISSN1007—8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMo