驱动蛋白Kif18A多克隆抗体的制备、纯化及免疫特异性检测.pdf

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1、第47卷第1期东北师大学报(自然科学版)Vo1．47No．12015年3月JournalofNortheastNormalUniversity(NaturalScienceEdition)March2015[文章编号]1000—1832(2015)Ol一0129—06[DOI]10．16163／j．cnki．22—1123／n．2015．O1．024驱动蛋白Kif18A多克隆抗体的制备、纯化及免疫特异性检测王庐宇，朱长军(天津师范大学生命科学学院，天津300387)[摘要]采用标签蛋白诱导表达纯化、蛋白质谱、WesternBlot、免疫荧光染色等多种分子生物学与细胞生物学方法，探

2、究了一种制备蛋白特异性多克隆抗体、检测抗体并且运用抗体获得蛋白翻译后修饰信息的实验思路．结果表明，使用这种方法可以高效地得到Kifl8A的兔源多克隆抗体．得到的抗体血清可以很好地应用于WesternBlot(蛋白免疫印迹)、Co—IP(免疫共沉淀)等分子生物学实验．将抗体血清纯化后可以应用于免疫荧光染色实验，并可以获得良好清晰的实验结果．此外，利用制备出的Kifl8A特异性抗体对细胞内源性Kifl8A进行Co-IP实验后进行质谱分析，得到了内源性Kif18A蛋白翻译后的修饰信息，为研究Kif18A蛋白的定位与功能奠定了良好的基础．[关键词]驱动蛋白Kifl8A；多克隆抗体；蛋白质

3、谱；蛋白磷酸化[中图分类号]Q291[学科代码]180·21[文献标志码]A在已知的40余种驱动蛋白(kinesin)分子中，Kifl8A蛋白近年来受到了越来越多的关注．在先前的文献中报道，Kifl8A蛋白分子在体外实验中证实具有微管解聚活性．这不同于早期报道中典型的驱动蛋白分子的特性．先前认为驱动蛋白家族分子中有些具有微管解聚酶功能(如Kif2C，即MCAK蛋白)，有些可以沿细胞骨架运动(如Kif5A)．但是，像Kif18A蛋白这样两种功能兼具的分子还比较罕见[1]．近年来国际上关于该蛋白分子的文献报道数量达到数十篇，其中最为引人关注的焦点在于Kifl8A蛋白对于细胞分裂进程的

4、正常进行以及纺锤体功能和形态的影响起到了至关重要的作用．尤其是Km8A蛋白在有丝分裂前中期对于染色体正确排列的重要意义以及Kif18A与细胞纺锤体中期检验点的密切关系更是成了最近5年的研究热点．此外，Kifl8A蛋白在某些肿瘤的发生、发展或迁移的过程中都发挥到了相应的作用[2。]．为了能够通过细胞内或细胞外实验对该蛋白分子进行深入的研究，必须要得到纯度和效价都极高的特异性Kill8A蛋白抗体，为此，本文设计了制备Kif18A特异性抗体的实验，以满足实验室对于该蛋白分子在细胞和分子生物学层面的研究需要．1实验材料与方法1．1材料人宫颈癌细胞HeLa，本实验室自存；pEGFP—Kif

5、18A(C297)质粒为本实验室先前构建；pGEX—KG载体、pET28a载体为本实验室自存．感受态大肠杆菌(E．coli)复制菌株Top10、表达菌株BL21购自TransGen公司．DNA限制性内切酶EcoRI和SalI以及T4DNA连接酶购自Thermo公司；X-HindⅢ[收稿日期]2013—11—24[基金项目]国家自然科学基金面上项目(31271485)；国家自然科学基金青年基金资助项目(31301138)；2011年教育部“新世纪优秀人才支持计划”资助项目(NCET-11—1066)；天津市应用基础与前沿技术研究计划重点项目(12JC2DJC214oo)．[作者简介

6、]王庐宇(1987一)，男，硕士研究生；通讯作者：朱长军(1972一)，男，博士，教授，主要从事细胞分子生物学研究．13O东北师大学报(自然科学版)第47卷digestDNAMarker购自TaKaRa公司．其他试剂为进口原装、分装或国产分析纯．DNA测序工作委托金唯智公司进行，蛋白质谱分析工作委托军事医学科学院国家生物医学分析中心进行．1．2GST与His标签融合蛋白表达质粒的制备驱动蛋白8家族分子靠近C端部分包含多个结合功能域且暴露在外，为了得到特异性Kif8A的抗体，实验中设计采用Kifl8A蛋白分子C端297个氨基酸的区段作为抗原，免疫后得到该蛋白分子的多克隆抗体．前期，

7、本实验室已制备出pEGFP—Kif18A(C297)的真核表达质粒，本实验使用限制性内切酶EcoRl和SalI将该质粒在37℃条件下双酶切2h，同时将pGEX—KG载体质粒与pET28a载体质粒37℃条件下双酶切2h．随后在1琼脂糖(B10wEsT)凝胶中进行电泳，将酶切后的目的基因条带切下，使用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒将目的基因进行回收．使用T4DNA连接酶在16℃条件下将目的基因与载体连接过夜，从而构建出pGEX—KG—Kif18A(C297)(简