细菌氧化应活性氧高质荧光测定试剂盒产品说明书（中文版）.doc

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1、细菌氧化应激活性氧高质荧光测定试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细菌氧化应激活性氧高质荧光测定试剂是一种旨在通过透膜荧光染色剂氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯，在细菌氧化条件下，产生荧光，来定量检测细菌活性氧族的生成和增加的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种实验用细菌菌株氧化应激活性氧的分析。产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定，滞留持久，荧光清晰。技术背景细菌作为模式生物，是环境化学毒性研究的常用工具。活性氧的检测可以用于诸如多环芳烃化合物或重金属的毒性作用

2、以及修复（remediation）的评价指标。超氧自由基阴离子（superoxideradical；O2-）、过氧化氢（hydrogenperoxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxylradical；OH-）、过氧化基（peroxylradical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxylradical）、氮氧基（nitricOxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitriteanion；ONOO-）次氯酸（hypochloro

3、usacid；HOCl）、半醌自由基（semiquinoneradical）、单线态氧气（singletoxygen）等细胞内活性氧族（ReactiveOxygenSpecies；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluoresceindiacetate,acetylester；CM－H2DCFDA）是取代二氯二氢荧光素二乙酯（2´,7´-dichlorodihydrofluorescindiac

4、etate；DCFH-DA）的升级产品，一种完全自由通过细胞膜，并在细胞内长期滞留而不易外漏的染色剂。一旦被过氧化氢、羟自由基或氢氧基、过氧化基、次氯酸等氧化，便产生荧光。据此测定细菌活性氧族的浓度。产品内容清理液（ReagentA）毫升染色液（ReagentB）微升稀释液（ReagentC）毫升溶解液（ReagentD）毫升产品说明书1份保存方式保存染色液（ReagentB）在－20℃冰箱里，严格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月用户自备1.5毫升离心管：用于染色的容器微型台式离心机：用于样

5、品操作培养箱或恒温水槽：用于染色孵育200微升1厘米光径比色皿或黑色96孔板：用于荧光定量分析荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于荧光定量分析实验步骤一、直接测定1．准备好1毫升新鲜的待测菌液（OD600＝0.5；1X108细胞/毫升）2．移取200微升到1.5毫升离心管3．加入xx微升染色液（ReagentB），混匀4．转移到200微升1厘米光径比色皿或黑色96孔板5．放进37℃荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测（激发波长490nm，散发波长530nm）：每隔5分钟测读一次，持续120分钟――RFU增高，表明活

6、性氧族（ROS）含量增高6．构建活性氧和时间关系曲线二、培养上清测定1．准备好1毫升新鲜的待测菌液（OD600＝0.5；1X108细胞/毫升）2．移入到1.5毫升离心管3．放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf5415）4．小心移取200微升上清液到1.5毫升离心管5．加入xx微升染色液（ReagentB），混匀6．放进37℃培养箱里或恒温水槽孵育30至60分钟，避免光照7．转移到200微升1厘米光径比色皿或黑色96孔板8．放进37℃荧光分光光度仪或

7、荧光酶标仪检测（激发波长490nm，散发波长530nm）：――RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量增高三、细菌内测定实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（ReagentB）置入冰槽里融化。然后移出xx微升染色液（ReagentB）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升稀释液（ReagentC），混匀后，标记为染色工作液，置入冰槽里。然后进行下列操作。1．准备好1毫升新鲜的待测菌液（OD600＝0.5；1X108细胞/毫升）2．移入到1.5毫升离心管3．放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为1

8、000g（或3000RPM，例如eppendorf5415）4．小心抽掉上清液5．加入xx毫升预冷的清理液（ReagentA），混匀6．放进微型台式离心机离心10分钟，速度为1000g（或3000RPM，例如eppendorf5415）7．小心抽掉上清液8．重复实验步骤5至7一次9．加入xx微升含有染色液（ReagentB）和稀释液（ReagentC）的染色工作液，混匀10．放进37℃培养箱里或恒温水槽孵育30分钟，避免光照1