活体组织氧化应激活性氧ros初级荧光测定试剂盒

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1、活体组织氧化应激活性氧（ROS）初级荧光测定试剂盒产品说明书主要用途活体组织氧化应激活性氧（ROS）初级荧光测定试剂是一种旨在通过透膜荧光染色剂二氯荧光乙酰乙酸盐，在组织氧化损伤条件下，产生荧光，来定量检测组织内活性氧族的生成和增加的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。适宜于活体动物组织的分析。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简易，活体检测，性能稳定。技术背景超氧自由基阴离子（superoxideradical；O2-）、过氧化

2、氢（hydrogenperoxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxylradical；OH-）、过氧化基（peroxylradical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxylradical）、氮氧基（nitricOxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitriteanion；ONOO-）次氯酸（hypochlorousacid；HOCl）、半醌自由基（semiquinoneradical）、单线态氧气（singletoxygen）等细胞

3、内活性氧族（ReactiveOxygenSpecies；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。2',7'-二氯荧光乙酰乙酸盐（2',7'-dichlorofluoresceindiacetate，DCFH-DA）一种完全自由通过细胞膜的染色剂。一旦被过氧化氢、过氧化基、过氧亚硝基阴离子等氧化，便产生绿色荧光。据此测定组织细胞内活性氧族的浓度。产品内容清理液（ReagentA）300毫升染色液（ReagentB）1毫升稀释液（ReagentC）200毫升说明书1份保存方式保存染色液（ReagentB）在－20

4、℃冰箱里，严格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证12月用户自备50毫升锥形离心管：用于组织收集的容器15毫升锥形离心管：用于工作液配制和组织处理的容器1.5毫升离心管：用于工作液配制的容器6孔细胞培养板：用于组织染色的容器培养箱或恒温水槽：用于染色孵育荧光显微镜：用于观察荧光组织荧光分光光度仪：用于组织荧光定量检测实验步骤方法一：新鲜组织薄片定性检测实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（ReagentB）置入冰槽里融化，稀释液（ReagentC）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出25微升染色液（

5、ReagentB）到新的15毫升锥形离心管，加入2.5毫升稀释液（ReagentC)，混匀后，将染色工作液置入暗室里。然后进行下列操作。1．手术取出动物组织2．放进预冷的50毫升锥形离心管3．加入3毫升清理液（ReagentA）浸泡15秒4．用镊子取出组织，用无菌绵纸吸干5．即刻用刀片切离组织为1cmX1cm大小的片状组织6．用镊子将组织薄片放进6孔培养板的一个孔7．加入2.5毫升含有染色液（ReagentB）和稀释液（ReagentC）的染色工作液8．放进37℃培养箱孵育20分钟，避免光照（注意：如果组织薄片较

6、厚，可以增加孵育时间至60分钟）9．小心抽去染色工作液10．加入3毫升清理液（ReagentA）11．用镊子将组织薄片放在载玻片上12．压片13．即刻在荧光显微镜下观察（定性检测）：激发波长490nm，散发波长520nm――绿色荧光增强，表明活性氧族（ROS）含量高方法二：组织匀浆定量检测实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的染色液（ReagentB）置入冰槽里融化，稀释液（ReagentC）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出25微升染色液（ReagentB）到新的1.5毫升离心管，加入990微升稀释液（Rea

7、gentC)，混匀后，将染色工作液置入暗室里。然后进行下列操作。1．手术取出动物组织，并秤重以确定组织重量2．移取1克组织，放进预冷的50毫升锥形离心管3．加入3毫升的清理液（ReagentA）4．用镊子取出组织，用无菌绵纸吸干5．即刻用刀片切碎组织6．放进一个预冷的15毫升锥形离心管7．加入5毫升预冷的稀释液（ReagentC）8．涡旋震荡5秒，充分混匀9．即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器10．在冰槽里用研磨棒匀化组织（注意：切莫过度匀化）11．将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管12．置入冰槽里备用13．移

8、取5微升组织匀浆物进行蛋白定量检测14．移取50微升组织匀浆物（样品）或50微升稀释液（ReagentC）（背景对照）到1毫升石英比色杯里15．加入950微升升含有染色液（ReagentB）和稀释液（ReagentC）的染色工作液16．上下倾倒混匀17．放进37℃恒温水槽孵育20分钟，避免光照18．即刻放进荧光分光光度仪检测：激发波长490nm，散发波长520nm——（样