山羊睾丸支持细胞的分离培养及鉴定.pdf

《山羊睾丸支持细胞的分离培养及鉴定.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、2014sO镬巍2{期Reprod(~ctionandPhysk：)togy·豫整理山羊睾丸支持细胞的分离培养及鉴定姜颖，潘庆杰，张钦恺，李岩，徐君君(青岛农业大学动物生殖发育与基因工程研究所，山东青岛266109)摘要：本实验通过改良方法使山羊睾丸支持细胞能够在体外快速分离且较长时间培养。将山羊睾丸组织剪碎后经2种混合酶溶液(4mg／mL胶原酶IV与0．2％透明质酸酶混合液和0．25％胰酶与100g／mLDNaseI~E合液)次第消化．利用差速贴壁法纯化细胞悬液中的支持细胞，对培养72h的细胞经台

2、盼蓝染色鉴定细胞活率．观察支持细胞形态学特征及生长增殖情况，油红O染色、H．E．染色及福尔根染色对支持细胞进行鉴定。结果表明：染色结果观察到在细胞核周围有空泡状结构且有核小体存在，表明本实验分离培养的是山羊睾丸支持细胞．且纯度较高，充分证明了该改良方法可有效的分离山羊睾丸支持细胞并在体外较长时间培养。关键词：睾丸；支持细胞；分离；体外培养；山羊中图分类号：$827．3文献标识码：A文章编号：0258—7033(2014)21—0023—04睾丸支持细胞，又称足细胞、次细胞，由SertoliEll1材

3、料与方法发现，因此又称Sertoli细胞。在曲细精管中，支持细胞为精子的发生提供结构性支撑及稳定的壁龛。许多1．1材料实验动物3月龄崂山奶山羊禁食12～14h研究认为支持细胞能够分泌多种因子l21，为睾丸中后颈部放血处死，无菌条件下取一侧睾丸(带阴囊)，精子的形成提供营养l3l，因此对支持细胞体外培养酒精消毒后放入37~C含双抗的无菌PBS中，1～2h内带的研究成为探究雄性生殖细胞的基础。回实验室用于细胞分离培养。支持细胞是目前克服移植免疫排斥反应最具希主要试剂、溶液FI2／DMEM培养基、丙酮酸钠

4、、非望的细胞；支持细胞能够作为饲养层与干细胞体必需氨基酸、胎牛血清、台盼蓝染液、胰蛋白酶、青外共培养I；支持细胞为糖尿病和帕金森病的治疗链霉素溶液(Hyclone)，胶原酶IV、透明质酸酶、油红提供了新思路；有研究表明，睾丸支持细胞在体细O(Sigma)，DNaseI(上海生工)，明胶(Amresco)，胞动物克隆方面的可能性l7l。可见支持细胞体外分Feulgen染液(百浩生物科技)离培养在生物学研究领域具有重要作用且应用前景1．2方法广阔。杨润军等_8通过改良国外方法得到原代小鼠1．2．1山羊睾

5、丸支持细胞的分离与纯化3月龄崂支持细胞，之后又有研究报道了小鼠支持细胞的体山奶山羊禁食12～14h后颈部放血处死，无菌条件下外分离培养”。刘闯等ll2分离了新生牛睾丸支持细取一侧睾丸(带阴囊)，酒精消毒后放入37℃含双抗胞。随后，郑鹏等【13]和孙秀娟等【14】又报道了犊牛支持的无菌PBS中，1～2h内带回无菌室，剪除阴囊和鞘细胞的分离培养，但是以山羊作为实验动物研究膜，放入酒精中浸泡数秒，无菌PBS清洗3～5次，除去支持细胞的报道几乎没有。本实验以文献报道的白膜，剪取1～2g睾丸实质，用眼科剪去除

6、可见的血睾丸支持细胞培养方法为基础，改进消化液的组管和结缔组织，PBS洗2次，F12／DMEM培养基洗2次合、消化时问及纯化方法，有效分离且较长期培养后将组织块剪碎至1～2mm小块，移入50mL离心山羊睾丸支持细胞，为进一步探究和利用支持细管，加入5倍体积的4mg／mL胶原酶IV与0．2％透明质胞奠定基础。酸酶混合消化液，37℃消化30min离散曲细精管，加入F12／DMEM培养基冲洗后1200r／min离b5min，重收稿日期：2014—05一l3；修回日期：2014—06—24复2次，加入5倍体

7、积的预热的0．25％胰酶与10mL资助项目：国家转基因新品种培育重大专项(2011zx08008-DNaseI混合消化液，37℃消化15min，期间振荡数次，003)：山东省“泰山学者”建设工程专项经费资助之后加入等体积的含血清的细胞培养液终止反应，作者简介：姜颖(1989一)，女，内蒙古人，硕士研究生，主要从事动依次通过80、150目和300目不锈钢细胞筛过滤得到物生殖发育与基因工程的研究，E—mail：705160850@qq．COIII单细胞悬液，1200r／min离心5min后接种于经明胶通

8、讯作者：潘庆杰，E—mail：qipan@126．com中围蠡擞袈忿翱多繁鞠整瑷·ReproductionandPhysiology紫色，且可见核仁，细胞质被染成红色或紫红色，可见空泡状结构。由于支持细胞核中有卫星小体，所以有研究认为，可以通过Feulgen染色鉴定支持细胞l】6I。实验中还发现无水乙醇：冰醋酸=3：1的Carnoy同定液的效果优于无水乙醇6mL+冰醋酸1mL+氯仿3mL的Camoy固定液，且60℃盐酸中水解的时间控制是染色结果理想与否的重要步骤。Fe