抗人免疫球蛋白G的制备及其在免疫比浊中的应用.pdf

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1、国际检验医学杂志2011年7月第32卷第11期IntJLabMed，July2011，Vo1．32，No．11·检验试剂评价·抗人免疫球蛋白G的制备及其在免疫比浊中的应用岳菊香，杨锦云(1．四川省西昌市疾病控制中心615000；2．四川省凉山州第一人民医院，四川西昌615000)摘要：目的纯化人IgG，制备兔抗人IgG多克隆抗体，用于配制IgG的免疫比浊定量诊断试剂。方法用PEG-6000、辛酸沉淀、DEADSepharoseF．F离子交换层析纯化人IgG。纯化后的IgG免疫新西兰大白兔，并用相同方法纯化兔抗人IgG，配制IgG的免疫比浊定量诊断试剂并进行性能验证。结果纯化

2、的IgG纯度97，收获率68．4，配制试剂批内、批间CV分别为1．04、2．62，线性范围上限可达6O．15g／L，最大干扰率为4．8。结论该纯化方法简单易行，收获率高，配制的试剂品质优良，精密度、准确度高，抗干扰能力强。关键词：免疫球蛋白G；纯化；多克隆抗体制备；免疫比浊D0I：10．3969／j．issn．1673—413O．20l1．11．040文献标识码：A文章编号：16734130(2011)11—1227—02人血清免疫球蛋白G(IgG)透射免疫比浊定量测定试剂苗3mg／mL；取成年雄性新西兰大白兔，体质量2．0～2．5kg，中，抗人IgG来源多采用硫酸铵分级沉

3、淀，亲和层析人血清纯用人IgG1mg／kg配以等体积弗氏完全佐剂进行基础免疫；以化、免疫制备。硫酸铵分级沉淀需要透析耗时且大量抗体变性后每隔2周免疫1次，剂量为0．5mg／kg配以等体积弗氏不完极度影响最终收获率。亲和层析纯化虽然能得到令人满意的全佐剂进行免疫。第3次免疫后10d开始采血测效价，直到纯度抗体，但这一方法会丢失抗血清中高亲和力的抗体，影响琼脂双扩法测效价达到32，再次加强免疫3d，颈动脉放血，分制备血清的亲和力及效价。本实验探讨采用PEG-6000沉淀离血清，除脂一7O℃保存_4]。初提、浓缩；辛酸沉淀、DEADSepharoseF．F离子交换层析对1．2．5

4、兔抗人IgG纯化调整pH6．5然后逐渐滴加40的人血清IgG进行精细纯化。免疫新西兰大白兔，用PEG--6000PEG-6000，至终浓度为13，得沉淀物，完全溶解用DEAD沉淀、DEAE—SepharoseF．F离子交换层析纯化兔血清，制备兔SepharoseF．F层析纯化。抗人IgG。配制IgG透射免疫比浊定量测定试剂，并对配制的1．2．6试剂配制及检测抗血清稀释液为0．1mol／L，pH7．4试剂性能进行探讨。PB；反应液为PEG-600042．05g／L，NaF2．2g／L，Tris1．821材料与方法g／L，吐温2005mL；NaN31g／LNaC19g／L；抗血

5、清浓度选择1．1仪器及试剂BeckmanJ-20XP高速冷冻离心机；ITA—用方阵滴定法确定。反应曲线符合y—n+bX+cx2+dx3(yCHI7170全自动生化分析仪及配套Miniprotein3Cell：BIO—为吸光度值、x为抗原含量)，可以应用仪器的Spline定标方RAD公司电泳仪；ThermomultiskanMK3酶标仪；PEG-6000式。参考血清由卫生部上海生物制品研究所提供；仪器为Hi—为进口分装分析纯其他试剂为国产分析纯试剂；UnicoTMtachi7170全自动生化分析仪；终点法主波长：340nm副波长，UC-2102PC紫外可见分光光度计；Q_Se

6、pharoseFF：Amer—700nm反应温度，37℃反应时间，10min，将样品1O倍稀释后shamBiosciences。操作。1．2方法1．2．7试剂性能验证标本5O份分装冰冻待用。取混合血1．2．1人IgG纯化取健康人血清，调整pH6．5，逐渐滴加清l份重复测定IgG20次，计算其精密度。取混合血清1份4O的PEG-6000，至终浓度为13，室温静置30min，然后以分装成2O小份，低温保存，隔日测定共计2O次，计算变异系离心半径8cm，10000r／rain离心10min，去上清_1；用pH4．8数；准确度检测：测定卫生部临检中心免疫球蛋白定值血清。100mmo

7、l／L醋酸盐缓冲液少量多次加入至沉淀完全溶解，再干扰试验：取Hb浓度为2．5、5．0、10．0g／L的溶血各0．1mL，加2倍缓冲液稀释，用醋酸调整pH4．8，计量总体积。滴加辛分别加入1．0mL低(12．2g／L)、高(21．9g／L)浓度的IgG样酸至沉淀完全，每毫升样品中需25I辛酸，同时用力搅拌，室品中，进行干扰实验_5]。温下继续搅拌3Omin，以离心半径8cm10000r／min离心1o2结果min，保留上清_2]。上清液调整pH6．5加入4O的PEG-6000，2．1纯化结果调整pH6．5时IgG、I