实验多抗制备4免疫比浊

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1、沉淀反应微生物与免疫教研室本次实验内容实验一、双向免疫扩散试验——LDL多抗鉴定及效价测定实验二、免疫浊度测定——免疫球蛋白检测一、本次实验的目的：1、掌握可溶性抗原制备抗血清鉴定的常用方法。2、掌握双向免疫扩散试验方法。3、掌握抗体效价的判断。4、掌握免疫浊度的测定原理。5、熟悉免疫球蛋白检测的临床意义。沉淀反应（precipitation）可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合所出现的沉淀现象。分类液体内沉淀试验絮状沉淀试验环状沉淀试验免疫浊度测定凝胶内沉淀试验免疫扩散免疫电泳单向免疫扩散试验双向免疫扩

2、散试验火箭免疫电泳对流免疫电泳沉淀反应思考：抗原抗体反应的四大特点？特异性可逆性比例性阶段性沉淀反应的特点抗原为可溶性物质，如蛋白质、多糖沉淀反应分两个阶段：第一阶段、抗原抗体特异性结合(不可见)第二阶段、形成可见的免疫复合物（可见）条件电解质，温度，酸碱度凝胶内沉淀试验(gelphaseprecipitation)主要是指琼脂糖扩散或称凝胶扩散(geldiffusion)。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。★根据实验目的与方法不同，可将固相内沉淀验分为2类：（一）免疫扩散①单向免疫扩散试验(si

3、nglegeldiffusiontest)②双向免疫扩散试验(doublegeldiffusiontest)（二）凝胶免疫电泳(gelimmuno-electrophoresis)火箭免疫电泳双扩散免疫电泳一、单向免疫扩散试验(一)原理将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测的抗原物质在凝胶中自由扩散，与抗体结合形成沉淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。(二)操作步骤（平板法）1.将抗体和0.9%琼脂糖50-56℃混合,即刻倾注成平板。2.待凝固后在琼脂板上打孔,孔中加入已稀释的抗原溶液和不同浓度的抗原标准品溶液。3

4、.置37℃,让其向四周自由扩散,24-48h后可见其孔周围出现沉淀环。单向辐射状免疫扩散上排为5个不同的参考，中、下排为患者血清，下排右2为一异常病理血清(三)方法评价单向琼脂扩散试验是一种稳定、简便、毋需特殊设备，一般实验室均可使用的常规方法，试验的重复性和线性均好。敏感度为1.25mg/L(四)影响因素1.抗原分子量抗原分子量大，扩散慢，沉淀环较小；抗原分子量小，扩散快，沉淀环相对较大。要求待检血清和抗原标准品在血清学上具有均一性，否则可能出现结果偏高或偏低。2.抗体种类实验证明兔抗血清优于马、羊抗血清，兔抗血

5、清可测抗原0.1~1IU/ml，马抗血清为1~10IU/ml，羊为0.4~4IU/ml，为提高实验敏感度，应首选敏感度高的抗血清。3.抗体稀释度抗体浓度大，沉淀环小，则敏感度低；抗体浓度小，沉淀环增大，不同浓度抗原间的差别较显著，敏感度高。但沉淀环过大，常造成边缘糊不清，致使测量误差也增大。因此要求在沉淀环清晰的基础上加大稀释度以提高敏感度。二、双向琼脂扩散试验(一)原理将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成可见的白色沉淀线。沉淀线的特征与抗原

6、抗体的浓度、纯度和扩散速率等有关。(二)操作步骤（平板法）融化琼脂，浇板每张载玻片约4ml。凝固，打孔孔径3mm，孔间距3~5mm，孔型有双孔型、三角孔型、双排孔型和梅花孔型。加样在相对孔内加抗原或抗体。孵育使抗原抗体自由扩散，在两孔之间抗原抗体相遇，在比例适时形成可见的沉淀线。沉淀线的数目、形态和位置与抗原和抗体的纯度、浓度和扩散速度有关。(三)双向免疫扩散试验的应用1.检测未知抗原或抗体及其相对含量将已知的抗体或抗原与待检标本加入成对孔中根据沉淀线有无定性；根据沉淀线的位置估计抗原或抗体的相对含量根据沉淀弧形状

7、判断抗原或抗体的相对扩散速率。沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系A：Ag、Ab浓度及扩散率近似；B：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag＞Ab；C：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag＜Ab；D：扩散率近似，浓度Ag＞Ab；E：浓度Ag＞Ab，扩散率Ag＞Ab；F：浓度Ag＜Ab，扩散率Ag＜Ab2.抗原性质分析利用三角孔型，将待检抗原和标准抗原加入相邻两个孔中，与另一孔相对，根据沉淀线形状分析待测抗原，见图。三种扩散基本图型3.抗体效价滴定用梅花型孔，中间放抗原，周围孔放下不同稀释度的相应抗体，以出现沉淀线的最高稀

8、释倍数为该抗体的效价。效价检测结果该图是经过一次基础免疫，三次加强免疫，间隔七天之后，颈动脉取血所得血清测定的效价。免疫双扩散测效价，加样方式同上，从图中可以看出最后测得的效价分别为：1：256，1：128，1：128中间孔—抗原；周围孔——血清血清的稀释倍数分别为：孔1—1/8；孔2—1/16；孔3—1/32；孔4—1/64；孔5—1/128；孔6—1/2