免疫比浊分析.ppt

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1、免疫比浊分析是将液相内的沉淀反应与现代光学仪器和自动分析技术相结合的一项分析技术。第二节自动化免疫比浊分析第一节免疫比浊的原理一、透射免疫比浊法二、散射免疫比浊法三、免疫胶乳比浊法四、免疫比浊分析的影响因素和临床应用第一节免疫浊度分析原理抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成小分子免疫复合物（<19S），在增浊剂（如PEG、NaF等）的作用下，迅速形成免疫复合物微粒（>19S），使反应液出现浊度。这种浊度可用仪器检测，用吸光度表示。第一节免疫浊度分析原理在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复合物量随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦

2、随之增大，即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。免疫比浊技术分类：透射免疫比浊法（turbidimetricimmunoassay）散射免疫比浊法（nephelometryimmunoassay）速率散射比浊法终点散射比浊法一定波长的入射光线通过抗原抗体反应后的溶液时，由于溶液中的免疫复合物微粒对光线的吸收、反射和折射而使透射光减少，可用吸光度表示。在一定范围内，吸光度与免疫复合物量呈正相关，而形成的免疫复合物量与参与反应的抗原和抗体的量呈函数关系。一、免疫透射比浊法（一）原理：抗原抗体反应曲线1.将待检标本和抗原参考品作适当稀释。（二）

3、操作方法2.将待测标本和标准抗原溶液（5个浓度抗原标准品）与适当过量的抗血清混合，在一定条件下，抗原抗体反应完成后，在340nm处测定各管吸光度。3.按log-logit转换或y=ax3+bx2+cx+d方程进行曲线拟合，制备剂量-反应曲线，由计算机处理，计算出抗原浓度。待测的抗原抗体复合物分子量足够大。抗原抗体复合物数量足够多。具有充分的反应时间，只能测定抗原抗体反应的第二阶段。高亲和力的抗体，并保证抗体过量。（三）技术要求（四）方法评价优点:灵敏度高，稳定性好，操作简便，结果准确不足:①抗体用量较大；②溶液中存在的抗原－抗体复合物分子

4、应足够大③透射比浊测定在抗原－抗体反应的第二阶段，检测需在抗原抗体反应达到平衡后进行，耗时较长。粒子对光线的散射作用是溶液中的微粒子受到光线照射后，微粒子对光线产生反射和折射而形成散射光。悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等因素密切相关。二、免疫散射比浊法(一)原理不同大小的微粒形成的散射光分布不同。当微粒直径小于入射光的波长的十分之一时，散射光的强度在各个方向的分布均匀一致，称Rayleighae散射。当微粒直径大于或等于入射光的波长时，前向散射光远远强于后向散射光，称Mile散射。其中光线

5、偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物的大小和多少密切相关。当固定检测角度与发射光的波长时，散射光的强度与复合物的含量成正比，即待测的抗原越多，形成的复合物越多，散射光就越强。应选择适当的光源强度、反应时间、测量角度及光源的波长。另外，要注意保证抗原浓度合适。此外，还要选择适宜的离子强度、pH值等。(二)技术要求速率散射比浊法是抗原抗体结合反应的一种动态测定方法。所谓速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成免疫复合物的量（不是免疫复合物累积的量），连续测定各时间复合物形成的速率与其产生的散射光信号联系在一起，形成动态的速率散射比浊法，每项检

6、测仅1～2min即可完成。(三)速率散射比浊法（ratenephelometry）累计时间复合物产生总量产生速率510152025303540455055608132560150230300360415450480500—512359080706055453020抗原抗体复合物形成时间与速率的关系当抗体的浓度固定于一定范围时，复合物形成的速率峰值的高低与抗原的含量成正比，随着时间的延长，免疫复合物的量逐渐增多，抗原抗体结合速度的峰值在一定的时间出现。通过微机处理即可得到待测蛋白成份的含量。速率散射比浊法峰值出现的时间与抗体浓度及纯度直接相

7、关，需选用抗体纯度及亲和力交高的试剂。此外，要保证待测样本血清的性状符合要求，如严重脂血等即为不合格样本。技术要求(三)方法评价散射比浊法是目前临床应用较多的一种方法，本法自动化程度高，具有快速、灵敏、准确、精密等优点。采用抗原过量检测方法，保证了结果的准确性。但仪器和试剂价格比较贵,对抗体的质量要求很高。用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒（一般为0.2μm），在遇到相应抗原时，胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳颗粒凝聚，使透射光和散射光即出现显著变化。三、免疫胶乳比浊法（一）原理：三、免疫胶乳比浊法（一）原理：第二节自动化免

8、疫比浊分析（一）BN特种蛋白分析测定系统该系统的测定方法是透射免疫比浊法的一种改良。以发光二极管作为光源，检测前向角13～24度的散射光，然后利用硅化光电二极管接收散射光信号，经过微电脑处理，