抗人双特异性磷酸酶DUSP18单克隆抗体的制备及鉴定.pdf

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1、第28卷第5期广东教育学院学报2008年10月Vo1．28No．5JournalofGuangdongEducationInstituteOct．2008抗人双特异性磷酸酶DUSP18单克隆抗体的制备及鉴定彭建柳，陈小芳(广东教育学院生物系，广东广州510303)摘要：双特异性磷酸酶(DualSpecificityPhosphatase)是酪氨酸磷酸酶家族中的一员，这个家族中的成员既能对磷酸化酪氨酸去磷酸化，也能对磷酸化丝／苏氨酸去磷酸化．此外，它们还在有丝分裂原激活蛋白磷酸酶信号途径(MAPK)中起重要生理功能．为了制备

2、抗人双特异性磷酸酶的单克隆抗体(mAb)，以DUSP18重组蛋白为抗原免疫BALB／e小鼠，通过B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗相应磷酸酶的mAb．用Westernblot检测rnAb对重组蛋白和细胞中天然磷酸酶的反应性，共获得6株可稳定分泌抗磷酸酶1TIAb的杂交瘤细胞株，为进一步研究双特异性磷酸酶的去磷酸化作用机理以及其在有丝分裂原激活蛋白磷酸酶信号途径(MAPK)中的信号转导提供强有力的工具．关键词：双特异性磷酸酶；抗人双特异性磷酸酶单克隆抗体；单克隆抗体中图分类号：R318．5文献标识码：A文章编号：1007—8754(

3、2008)05—0073—06双特异性磷酸酶是酪氨酸磷酸酶家族中的一员，它参与生物体内信号转导、生长调控、新陈代谢等许多基本的生理活动n]．这个家族中的成员既能对磷酸化酪氨酸去磷酸化，也能对磷酸化丝／苏氨酸去磷酸化．目前已知，大部分双特异性磷酸酶都在有丝分裂原激活蛋白磷酸酶信号途径(MAPK)中行使重要生理功能．根据去磷酸化位点的特异性，可以将磷酸酶分为丝／苏氨酸特异性的磷酸酶和酪氨酸特异性的磷酸酶两大类．双特异性磷酸酶作为一类特殊的酪氨酸磷酸酶，它们既能对磷酸化酪氨酸去磷酸化，也能对磷酸化丝／苏氨酸去磷酸化．双特异性磷酸

4、酶的底物并不局限于蛋白质，著名的抑癌基因PTEN本身编码一个双特异性磷酸酶，它所作用的底物是细胞膜上的磷酸肌醇，能够对3，4一磷酸肌醇二磷酸和3，4，5一磷酸肌醇三磷酸分子糖环上的3位磷酸进行去磷酸化．1_3双特异性磷酸酶是近1O年来才被发现的一类酪氨酸特异性的磷酸酶，其数目正不断增加．目前哺乳动物中发现的双特异性磷酸酶成员已经达到30条．双特异性磷酸酶18(DuSP18)是从人类胎脑cDNA文库中克隆的新的酪氨酸磷酸酶，定位在人染色体的DUSP18的22q12．1位置上．DUSP18cDNA全长2450个碱基对，编码一个

5、188个氨基酸的蛋白质．这个蛋白质具有一个双特异性磷酸酶催化结构域，与其他很多双特异性磷酸酶不同的是没有CDC25同源结构域．DUSP18在几乎所有细胞系和组织中表达，利用原核表达系统证明了编码蛋白具有磷酸酶的活性．另外，DUSP18能在受胞外刺激时大幅提高自身表达量．细胞定位实验显示它在细胞核和细胞质中都有表达，它的定位都不随胞外刺激而改变．DUSPI8可能是体内SAPK／JNK重要调节因子，但其体内功能还不明确，目前研究认为与宫颈癌、胃癌、食管癌、口腔肿瘤等肿瘤的发生发展有密切关系．Is7]为了满足实验研究的需要，为免

6、疫受体介导的信号转导以及磷酸酶调节作用的研究提供重要的工具，本文通过抗人双特异性磷酸酶DUSP18单克隆抗体的制备及初步鉴定，获得6株抗人双特异性磷酸酶DUSP18的单抗，并在Westernblot鉴定中获得满意的效果．为进一步进行DUSP18的功能研究打下了良好的基础．收稿日期：2008—03～20作者简介：彭建柳，男，广东汕尾人，广东教育学院生物系讲师74广东教育学院学报第28卷1单克隆抗体的制备与鉴定1．1材料1．1．1抗原人双特异性磷酸酶(dualspecificityphosphatase18)，由上海提供．1．

7、1．2动物和细胞小鼠骨髓瘤细胞SP2／0细胞，达瑞抗体有限公司实验室保存；Balh／e小鼠，6～8周龄，雌性，体重18～2Og，购于广州中医药大学实验动物中心．1．1．3主要试剂1．1．3．1细胞培养用试剂HT、HAT、8一氮鸟嘌呤购Sigma公司；RPMI一1640粉剂购GIBCOinvitrogencorporation；胎牛血清(FBS)购于杭州四季青生物工程材料有限公司．1．1．3．2免疫学试剂辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG；福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂；免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒．1．1．4主要仪器设备CO。温

8、培养箱，酶联免疫检测仪，酶标洗扳机，蛋白检测仪，高速冷冻离心机，蛋白纯化系统，低速大容量多管离心机．1．2方法1．2．1小鼠脾细胞的制备1．2．1．1小鼠免疫初次免疫：5og抗原加等体积氟氏完全佐剂乳化到滴水不化后进行小鼠腹腔注射，注射体积500L／只．两周后第二次免疫．第二次免疫：50抗原加等体积氟氏