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《抗人ILT-4单克隆抗体制备及初步鉴定.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、238ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmunol)2008,24(3)·论著·文章编号:1007-8738(2008)03-0238-02抗人ILT24单克隆抗体制备及初步鉴定王春艳,李德敏,宋朝君,李娜,王东琳,金伯泉3(第四军医大学基础部免疫学教研室,陕西西安710032)[摘要]目的:制备抗人ILT4分子单克隆抗体(mAb)并进自杭州四季青生物工程材料研究所。HAT购自Gibco公司。行初步鉴定。方法:应用淋巴细胞杂交瘤技术,制备小鼠源PEGMW4000购自Merck公司。8周龄雌性BALB/c小鼠(二性抗人ILT4mA
2、b。用间接ELISA法测定腹水mAb的效价。级)由本校实验动物中心提供。小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0从以Westernblot测定mAb的抗原结合活性。通过流式细胞术澳大利亚IMVS引进。福氏完全、不完全佐剂购自Sigma公(FCM)对mAb结合转染细胞表面及天然细胞表面ILT4分子司。检测小鼠Ig类和亚类的试剂盒购自Pierce公司。Western的活性进行鉴定。结果:获得7株分泌抗ILT4mAb的杂交瘤blot试剂盒购自Roche公司。PVDF膜购自Amresco公司。标-6细胞株。ELISA法测定腹水mAb的效价均达1×10,7株准蛋白购自BioRad公司。FITC
3、标记的羊抗小鼠IgG抗体购mAb均为IgG1(κ)。Westernblot结果显示,3株mAb与人自B&D公司。ILT4有良好的结合活性。用转染细胞及U937细胞做FCM分1.2方法析发现另外4株mAb可结合真核表达的及天然的ILT4分子。1.2.1分泌抗人ILT4mAb的杂交瘤细胞株的建立用人结论:获得7株能特异性识别ILT4分子的mAb,为研究ILT4ILT4抗原加福氏完全佐剂混合并充分乳化后,皮下多点注射分子的组织分布和功能研究提供了可靠的实验手段。于BALB/c小鼠,第2次加用福氏不完全佐剂,间隔4周。第[关键词]ILT4;淋巴细胞杂交瘤技术;单克隆抗体3次腹腔
4、免疫。每次免疫每只小鼠均用抗原20μg。融合前[中图分类号]R392.11[文献标识码]B3d用同等剂量的抗原生理盐水溶液腹腔加强免疫1次。细[4]胞融合、筛选、克隆化及腹水制备均按常规实验操作进行。免疫球蛋白样转录物4(immunoglobulin2liketran21.2.2mAb效价及Ig亚类的鉴定将腹水按系列稀释后,script,ILT4),又称白细胞免疫球蛋白样受体2(leu2采用间接ELISA法检测腹水中mAb的效价。用小鼠Ig类和kocyteimmunoglobulin2likereceptor,LIR2)、CD85d及亚类试剂盒鉴定每株杂交瘤细胞培养上清
5、中mAb的Ig亚类。LILRB2是一种主要表达于髓样单核细胞表面的受1.2.3Westernblot检测抗ILT4mAb的特性用Westernblot[1]鉴定其与变性ILT4蛋白的反应性及相对分子质量(Mr)。取体。ILT是一类在基因和分子结构上以及功能上5μg人ILT4加入到2×上样缓冲液中,经120g/L的SDS2同KIR相关的膜分子。ILT4表达于单核细胞、树突PAGE后,转移至PVDF膜上,用50g/L脱脂奶粉(TBS)室温状细胞、巨噬细胞等髓样细胞。ILT4可结合经典封闭1h。依次滴加以封闭液(1∶1000)稀释的抗人ILT4腹水[2]MHC2I分子及非经典
6、MHC2I分子HLA2G,抑制钙(室温孵育2h或4℃过夜,洗膜3次)及1∶1000HRP标记的内流,胞质区募集SHP21蛋白酪氨酸磷酸酶,抑制受山羊抗小鼠IgG(室温孵育1h,洗膜3次),最后加发光底物体内化,并抑制抗原进入内体进行加工。ILT4可能(鲁米诺)显影。参与调控髓样单核细胞介导的细胞毒活性及炎症反1.2.4FCM检测抗ILT4mAb结合转染细胞及天然细胞表面[3]应,并调节抗原提呈功能,防止自身免疫应答。我ILT4的特性用PBS调整转染细胞或U937细胞的密度为们采用小鼠淋巴细胞杂交瘤技术,制备了小鼠抗人91×10/L,每管中加入1mL细胞悬液,再以上述条件
7、离心。ILT4分子不同表位的单克隆抗体(mAb),为进一步去上清,加入100μL100mL/L山羊血清室温封闭10min,分研究ILT4分子结构和功能的关系提供了重要的工具。别加入腹水1μL(同型对照管中加入小鼠抗SEDmAb腹水),于4℃孵育1h。洗3次后,离心,用100μLPBS重悬细胞,1材料和方法加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG1μL,于4℃避光孵育1h。洗3次后离心,用300μLPBS重悬细胞,以FCM检测。1.1材料人ILT4重组蛋白由牛津大学分子医学研究所提供。RPMI1640干粉购自Hyclone公司。新生牛血清(FCS
