酵母常规透射电镜样品制备方法的比较与改进.pdf

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1、第34卷第1期电子显微学报Vo1．34．No．12015年2月JournalofChineseElectronMicroscopySociety2015-o2文章编号：1000—6281(2015)01—0085—04酵母常规透射电镜样品制备方法的比较与改进梁静南，杨琳，赵彤，刘一苇(1．中国科学院微生物研究所，北京100101，2．中国科学院遗传与发育生物学研究所分子发育生物学国家重点实验室，北京100101)摘要：透射电镜技术中前期样品制备是获得最接近样品真实结构信息的关键。本文选择酵母为观察对象，运用常规样品制备技术

2、，观察不同缓冲液、不同脱水时间和脱水温度对酵母超微结构的影响，优化了酵母常规透射电镜前期制样方案。关键词：酵母；透射电镜；缓冲液；脱水中图分类号：Q336；Q949．326．1；Q949．327．1文献标识码：Adoi：10．3969／j．1000—6281．2015．01．015应用透射电子显微镜观察生物样品细胞内超微华研究员赠送。Lee’SGlucose液体培养基25℃过结构是生物学研究的重要手段之一，最大程度接近夜培养后，平板划线分离得到灰菌和白菌两种单菌真实呈现样品的结构信息是电镜技术不断改进的落。灰菌为杆状，白菌

3、为球状，是酵母BJ1097两种目标。不同生命状态，分别将其单菌落细胞再次接入液体常规透射电镜样品制备环节中缓冲液的组分对培养基增殖培养，过夜备用。维持固定液反应体系渗透压和pH值的稳定起着重1．2实验方法要作用⋯。二甲胛酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液1．2．1前固定(PBS)是最常用的无机盐类缓冲液，因砷盐受分别配置A，B两组缓冲液。A组为0．2mol／热分解产生有毒砷化物气体，并不是我们常规实验L，pH6．8的磷酸盐缓冲液；B组为0．2mol／L，pH的首选缓冲液；哌嗪一1，4-二乙磺酸(PIPES)是广泛6．8的PIPES缓

4、冲液，用NaOH调节其pH值，缓冲应用的有机物缓冲液之一，可用于处理酵母的透射液体系含1mmol／LMgC12；1mmol／LCaC12；0．1电镜样品前期制备。本文首先选择PBS和PIPESmol／L山梨醇。缓冲液对样品进行分组处理，观察比较二者对酵母分别用A，B两组缓冲液配置2×前固定液，即超微结构的影响。含5％戊二醛(SPIEM)和1％多聚甲醛(SPIEM)的此外，脱水也是常规电镜样品制备的重要环节固定液。将其分别与等体积的灰菌和白菌培养液混之一，脱水时间可以从3～5min到1～2h不等，一合，分别标记为Ga，Gb；

5、Wa，Wb。4℃静止5min般为10～20min。脱水时间过长，易对细胞内物后，1500g离心5min，弃掉上清液，收集约25L菌质过度抽提；脱水时间过短，不利于后续包埋剂渗体，加入1×前固定液，4cC固定2h后去离子水漂透。关于酵母细胞的脱水时间和温度在多数文献中洗5次，每次5min。并没有详细报道。因此，本文还针对脱水时间和温1．2．2琼脂糖包埋度做了分组实验。最终改进和优化了酵母常规透射将约25L菌体打入到37℃水浴的2％琼脂电镜样品的制备方案。糖液中，冰块迅速冷却后，用刀片切割成1mm×1mm小块，每个样品取两块待

6、后续处理。1材料和方法1．2．3后固定1．1实验材料1．5％的高锰酸钾4℃固定2h后，去离子水漂酵母BJ1097由中国科学院微生物研究所黄广洗3次，每次5min。收稿日期：2014—09—17；修订日期：2014—11—04作者简介：梁静南(1980一)，女(汉族)，黑龙江人，硕士，工程师．E—mail：liangjn@im．aC．cn通讯作者：刘一苇(1957一)，男(汉族)，北京人，研究员．E-mail：liuyw@im．ac．cn88电子显微学报J．Chin．Electr．Microsc．Soc第34卷以满足逐级脱水

7、后渗透液完全渗透的目的，而且对pages·细胞内膜结构包括线粒体的结构有更好保护作用。[3]RobinWright．Transmissionelectronmicroscopyofyeast[J]．MicroscopyResearchandTechnique，2000，51本文应用高锰酸钾对酵母细胞进行后固定，实(6)：496—510．验表明，经此处理后样品无需常规醋酸双氧铀和柠[4]MamiKonomi，KazushiFujimoto，TakashiToda，et．a1．檬酸铅的染色处理，在配置Gatan832的JEM一

8、1400Characterizationandbehaviourofd—glucansynthasein型透射电镜下观察，可以清晰看到细胞内的细胞壁、Schizosaccharomycespombeasrevealedbyelectron细胞膜、线粒体、高尔基体、内质网和细胞核等细胞microscopy