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1、LivinguptoLifeleica常规生物透射电镜样品制备概要1•取材及固定固定的目的是尽可能使细胞中的各细胞器以及大分子结构保持生活状态，并且牢固地固定在它们原来所在的位置上般来说I占1定有以下作用：1、破坏细胞的酶系统，阻止细胞的自溶；2、稳定细物质成分，如核酸、核蛋白，糖类和指类，使之发生交联，减少或避免抽提作用，以保存组织成分:3、在一些细胞组分之间以化学反应和物理反应建立交联，以提供一个骨架来稳定各种细胞器的空构型：4、能提供一定的电子反差L1动物及人体织的取材I占I定组织样品最重要的问题是速度，I占I定太慢会导致超微结构的改变111注定有
2、条件尽可能活体灌注固定。先腹腔注射巴比妥酸盐麻赛实验动物（如比妥钠.20-30mg/kg）•打开腹腔，由腹主动脉插入针管，在肝脏附近切开一处静脉，启动蠕动泵开始灌注。先灌注PBS冲洗液（37C,体积约13倍血液体积，200g大鼠约需要10ml）,可以在PBS内加入抗凝血剂防止血液凝固，然后灌注固定液（先37°C,再4°C）,续5-10分钟，另一种灌注方法通过左心室，这种方法需要打开胸腔，动物呼吸停止，针管由左心室插入升主动脉，剪开右心耳，随后的步骤与上述灌注一样。这种方法在胸腔打开后呼吸会立即停止，要求操作者尽快进行后续操作另外，向心脏插针管比向腹主动脉
3、插针管要简单些，特别是对于一些很小的实验动物灌注后取出组织，切成1伽】见方小块，再后用相同固定液I古I定30-60分钟左右112新检实样定血管不发达的组织，快速活体取材后立即投入固定液，同样，活检样品也要立即投入固定液，然后再尽快切成小块。方法如下:麻醉或断头急性处死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一小块组织，放在干净的纸板上，滴一滴冷却的固定液,用新的、无油污锋利的《双面》刀片将材料切成大约1価宽m长的小块，再将其切成伽的小块，取材要尽量快速准确如果有方向要求，如一些空腔器官、皮肤、角膜等，要注意方向性，保证需要观察的部位准确取到。最后用牙签将这些小块
4、逐一故入盛有冷的新鲜固定液的有青素小瓶里，放入冰箱冷藏室低温固（4°C）过夜。尽快中心实验室进行处理1・2培养的取材生长在培养瓶和培养板中的培养细胞取材时，悬浮细胞可直接离心，贴壁细胞应先倒岀培养液，采用胰蛋白酶消化用细胞刮刮下。而后带培养液进行低速离心（1000〜1500pm）lOmin左右，离心完倒出培养液，管底的细胞团不要打散，沿管壁缓慢倒入适量的（一般为材料体积的5〜10倍）2.5〜3%戊二醛固定液，因定约lh,也可在4°C冰箱
5、古
6、定过夜。尽快送中心实验室进行后固定，也可自己用1%酸固定后送样1植物组织的取材植物组织的取材比较容易，植物细胞离体
7、后变化不象动物细胞那样迅速，但植物细胞的细胞壁阻碍看I占I定液的迅速渗透因此，植物材料的取材宜切成薄片状，经适当固定后再切成小方块。如相织含有较多空气，不易下沉浸入I古I定液，可以使用真空泵抽气方式使之下沉14取材及定基本求快取材的动作要迅速，最好在材料离体后lin内就进入固定液，最好不要超过lOmin解剖器械要锋利（可使用新的双面刀片），避免拉和挤压，尽量减少取材中的机械损伤取材要准确，器官要准确，部位要准确：如胃肠道、皮肤和角膜。视网膜、耳蜗等一定要注意方向性，确保要观察的部位在切面方向。组织块的包理方向与切面方向要十分清楚，尽量自己在包埋前进行定位
8、冷取材过程应尽量在低温下进行（0-40,以降低酶的活性，减少细胞内结构的损伤小所取材料体积要小，一般不超过1可以取成条状，但截面约1因为固定剂的渗透力较弱，若组织块太大，块的内部将得不到良好的固定15常用冲波和定配方冲母液肥方A.请冲（0.2M）配制方法如下甲液:Na2HP0412H20,7164g,加蒸馆水溶解成10乙液:NaH2P042H20,31.21g加蒸憾水溶解成1按下表混合甲、乙两液即得50ml所需pH的磷酸缓冲液pH7.07.4甲液30.536040.5乙液m6.73129.514.09.5磷酸盐线冲液对细胞无毒性作用，常用于配制戊二醛固定
9、液，并适干作灌注固定。本缓冲液的缺点是固定时容易产生沉淀，并容易生长细菌，不能长期储存兰州大学电中心Pase1/14LivinguptoLifeleica平FAs甲醛,Formaldehyde,简称FA,分子式0CH2,分子量30.FA只有一个自醛基可以与氨基酸反应，分子间形成亚甲基桥产生交联作用，高pH环境（pH8和高FA浓度会增强分子间亚甲基桥的形成（Fox等，1985）.直接使用高浓度固定剂会导致样品收缩变形，可使用低浓度FA（2%）进行初始固定，随后再进行高浓度I古I定，FA穿透速度很快，结构信息保存完好，特别是长时间固定之后（8-72小时），但
10、是FA的固定作用是部分可逆的，固定后的样品如果长时间浸泡在没有固定剂的冲液，FA
