骨髓间充质干细胞对糖尿病肾病大鼠足细胞相关分子nephrin表达的影响.pdf

《骨髓间充质干细胞对糖尿病肾病大鼠足细胞相关分子nephrin表达的影响.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、中国中西医结合肾病杂志2014年7月第15卷第7期CJITWN，JYo1．，：!·短篇论著·骨髓间充质干细胞对糖尿病肾病大鼠足细胞相关分子nephrin表达的影响盖维①戴春②吕昌云③[摘要]目的：研究骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)对糖尿病肾病(diabeticnephropa-thy，DN)大鼠足细胞相关分子nephfin表达的影响及其对肾脏的保护作用。方法：将清洁级雄性sD大鼠52只随机分为aY-常组(n=13只)、造模组(1／,=39只)，正常组给予普通饲料，造模组则高脂高糖喂养，8周

2、后造模组一次性腹腔注射链脲佐菌素(streptozocin，STZ)35ms／kg，DN造模成功后将造模组随机分为BMSCs组(／2=13)、前列地尔组(n=13)、DN组(n=13)。于造模成功的当天，BMSCs组大鼠经尾静脉注射经体外培养、鉴定、Brdu标记后的BMSCs(2x10。／m1)，前列地尔组为经腹腔注射前列地尔4tLg·kg～·d～，而DN组及正常组则注射同等剂量的生理盐水。于注入后的第l天、14天、28天检测四组大鼠血糖、24h尿蛋白、血尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)；光镜下观察肾脏组织病理变化，荧光显微镜下观察BMSCs在肾脏的

3、定位；利用免疫组化、western—blot检测肾组织nephfin的表达。结果：BMSCs移植后的第28天，与DN组和前列地尔组相比，BMSCs组大鼠尿蛋白、肌酐、尿素氮均有下降(P<0．05)；BMSCs组大鼠足细胞nephfin的表达较正常组降低，但较DN组和前列地尔组明显上升(P<0．05)；BMSCs组大鼠肾组织可见Brdu标记的阳性细胞。结论：BMSCs可以上调足细胞nephfin的表达，改善足细胞融合，并促进足细胞再生，从而减少尿蛋白，对肾脏起到一种保护作用。(关键词]骨髓间充质干细胞糖尿病肾病nephfin糖尿病肾病(diabetic

4、nephropathy，DN)早期表现为微量蛋博士德；兔超敏三步法检测试剂盒，北京中杉金桥公司；DAB显白尿，可致进展性肾功能损害。蛋白尿的发生与肾小球的滤过色试剂盒，北京中杉金桥公司；前列地尔注射液(凯时)，北京泰屏障有关，足突是。肾小球滤过屏障成分之一，而足突是由分布德制药股份有限公司；山羊抗小鼠IgG／FITC，北京中杉金桥公于足细胞上或裂孔隔膜的蛋白分子组成，例如nephfin、podo—司；链脲佐菌素STZ，sigma公司；Marker(thermoscientificcin、WT1等。pierce)，B—action一抗、B—action

5、二抗，徐州医学院神经生物BMSCs是属于成体干细胞中的非造血干细胞，有多种分化实验室购买；RIPA裂解液，上海碧云天生物公司。能力，可以分化为骨、肌肉、脂肪等，最初是由Friednstein和2方法Petrakova在骨髓中发现的⋯，且骨髓间充质干细胞(bonemar-2．1BMSCs的分离、培养及传代SD雄性大鼠2只颈椎rowmesenchymalstemceils，BMSCs)还具有独特免疫调节和诱脱臼处死，75％乙醇浸泡8min，于超净工作台中，将骨骺端剪导免疫耐受功能。BMSCs可经细胞间直接接触和分泌可溶性去，暴露两端骨髓腔，10％胎牛血清

6、反复冲洗骨髓腔，收集冲洗细胞因子，抑制丝裂原、抗体或同种异体抗原刺激引起的液到无菌离心管中，4oC1200r／min离心5min。去上清液，加T淋巴细胞增殖。促进B细胞增殖和分泌免疫球蛋白J，抑L—DMEM培养基充分吹打成单细胞悬液，接种于培养瓶中，置制树突状细胞成熟和向淋巴迁移J。BMSCs能诱导细胞外基于37℃、5％CO：恒温孵育箱。72h首次换液，之后每3d换液质形成，调节淋巴细胞稳态和造血前体细胞分化，支持和更新1次，至细胞生长融合达80％～90％时，用0．25％胰蛋白酶消免疫系统、参与免疫调节、诱导免疫耐受J。化，按1：3比例进行细胞传代培

7、养。倒置显微镜下逐日观察细本实验通过建立DN大鼠模型，经尾静脉注入BMSCs，观胞形态。察BMSCs在肾脏的定位，用免疫组化和wes~m—blot方法检测2．2BMSCs的表面抗原鉴定生长良好的第3代BMSCs足细胞nephrin的表达，进一步探讨BMSCs对DN的保护作用。胰酶消化后，PBS洗涤制成2×10／ml的单细胞悬液，备5个2mlEp管，管上标记抗体信息，分别加入2ml的细胞悬液，依材料与方法次力Ⅱ人FITC—CD29、HTC—CD34、FITC—CIM5、PE—CD90，混1材料匀，最后一个为空白对照，室温避光孵育30min，流式细胞仪1

8、．1实验动物清洁级健康雄性SD大鼠52只，体重检测。(180±10)g，由徐州医学院动物实验中心提供。2．3