骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病足溃疡与其vegf表达的实验研究

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1、骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠糖尿病足溃疡及其VEGF表达的实验研究硕士研究生：董方导师：蔡黔副教授兰州军区兰州总医院烧伤整形科甘肃兰州730050中文摘要目的：建立一种简单、稳定、便于测量的大鼠糖尿病足溃疡模型，初步探讨局部移植异体骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗大鼠糖尿病足溃疡的效果及血管内皮生长因子(VEGF)在全身及局部的表达情况。方法：50只雄性Wistar大鼠随机分为对照组(10只)和造模组(40只)，造模组大鼠高脂喂养后腹腔注射链脲佐菌素(STZ)45mg／kg，对照组注射等量缓冲液。监测两组空腹血糖、体重、饮水量、尿量及股动脉超声多普勒血流学变化。

2、符合血糖≥16mmol／L及多饮、多尿、体重减轻等症状后，将两组大鼠足背部切除一3cm×7cm矩形全层皮肤组织，建立糖尿病足溃疡模型，比较二组溃疡愈合时间。常规采集MSCs，贴壁法分离、培养、纯化大鼠MSCs，取90只雄性Wistar大鼠糖尿病足溃疡模型，随机分为三组，正常对照组(A组，n=30)、骨髓间充质干细胞移植治疗组(B组，n=30)、糖尿病对照组(C组，n=30)。B、C两组溃疡形成后第l天于溃疡周围边缘lcm处四点皮下肉膜层注射移植O．1ml计数后细胞悬液，并同时于造模后第1、4、8天用软件Image—ProPlus6．0记录三组大鼠的愈合面积、细胞

3、核荧光染色示踪、ELISA法检测外周血VEGF浓度、western．blowing检测测局部VEGF表达强度、病理学观察及免疫组化检测CD34表达。结果：1．糖尿病造模组40只注射STZ后，有30只大鼠血糖乏16mmol／ml，并有多饮、多尿、多食、消瘦等症状，一周后行多普勒血流学检查，造模组符合动脉粥样硬化性血流频谱变化，对照组血流频谱正常。2．形成溃疡模型后，造模组平均愈合时间(12．51±1．21天)明显较正常大鼠愈合时间(9．67±0．87天)延迟(P

4、梭型、多角型骨髓间充质干细胞，第12天骨髓间充质干细胞可于培养皿底融合80％"-'90％，传代后1、2、3代第10天左右可基本融合，第2、3代呈均匀一致的长梭形。4．溃疡形成第l天注射移植MSCs细胞于溃疡周围，移植后1、4、8天行冰冻切片观察，均可见淡蓝色荧光聚集生长于溃疡周围皮下；5．细胞移植后平均愈合面积第4天可见B组(溃疡面积23．62±2．26mm2)愈合明显较C组(溃疡面积25．50±6．79mill2)快，但仍慢于A组(20．16±3．68mlllz)；第8天检测A、B、C三组结果同第4天(溃疡面积A组3．64±O．92mm2，B组7．56±1．9

5、1l'nm2，C组13．20±1．74rnlTl2)，B组明显较C组愈合速度快，但仍达不到A组水平。5．VEGF外周血浓度测定为：第4天(A组1．58±0．06u∥L，B组1．53±0．08ug／L，C组1．04±0．05pg／L，p<0．01)；第8天(A组1．70±0．04p∥L，B组1．50±0．04u∥L，C组1．14±0．07ug几，p<0．01)均可见B组浓度低于正常水平，但高于C组。6．局部VEGF表达强度：C组(第1天O．21±O．02，第4天0．24±0．02，第8天O．19±0．02)在1、4、8天均明显低于A(第1天1．04±0．05，第4

6、天1．81±O．06，第8天1．64±O．06)、B组(第l天2．44±O．25，第4天2．86±0．11，第8天0．85±O．06)；B组高于A组；第4天B组显著高于A组，但第8天，B组低于正常水平A组。7．MSCs移植注射后第1、4、8天检测CD34+累积光密度(IOD值)可见A组(第1天0．220-a：0．031，第4天0．279士0．038，第8天0．394士0．102)较B(第l天0．138士0．01，第4天0．189士0．021，第8天0．361士0．032)、C组(第1天0．142士0．042第4天0．173士0．03l第8天0．322士0．016

7、)表达高，第1、4天B、C组无差异，造模第8天，B组较C组表达高，各组内差异均有统计学意义8．病理切片观察可见B组在肉芽生长及表皮覆盖速度明显较C组快，但仍然较A组为慢。结论：1．通过本实验建立的动物模型，更加符合糖尿病足溃疡的临床、病理生理特点，具有简便、经济、稳定、易于测量等优点。2．．骨髓间充质干细胞易于获得，移植后可稳定定居于溃疡局部。3．异体单次移植MSCs可促进糖尿病足溃疡的愈合。其修复机制可能是通过上调了局部、全身外周血VEGF的表达，进而促进了局部微血管的形成，但单次异体移植不足以导致局部VEGF的持续分泌。关键词：骨髓间充质干细胞；血管内皮生长

8、因子；糖尿病足：溃疡；大