大肠杆菌菌影制备及介导pEGFP-N1在RAW264.7细胞中表达.pdf

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1、第35卷第3期扬州大学学报(农业与生命科学版)Vo1．35No．32014年9月JournalofYangzhouUniversity(AgriculturalandLifeScienceEdition)Sep．2O14大肠杆菌茵影制备及介导pEGFP—N1在RAW264．7细胞中表达焦红梅，贺丽，杨慧，李国才，陈红菊，严华，戴华，季明春(扬州大学医学院，江苏扬州，225001)摘要：通过PCR扩增噬菌体PhiX174裂解基因E，并将其插入到温控表达载体pBV220中，构建重组温控表达质粒pBV220一E。将重组质粒p

2、BV220一E转化至大肠杆菌DH5a中，升温到42。C诱导E基因的表达。将真核表达质粒pEG—FP—N1与大肠杆菌菌影孵育后转染小鼠巨噬细胞RAW264．7，荧光显微镜观察pEGFP—N1的表达情况。结果表明：扩增的E基因全长为276bp，与GenBank公布的基因序列一致。电镜观察结果显示，细菌表面出现跨膜孔道，细菌内容物经孔道排出形成空壳。荧光显微镜观察结果显示，大肠杆菌菌影介导的pEGFPN1在小鼠巨噬细胞中获得表达。为进一步研究以细菌菌影为基础的新型灭活疫苗和载体疫苗提供参考依据。关键词：大肠杆菌菌影；噬菌体P

3、hiXl74；裂解基因E；温控表达；转染中图分类号：Q785；S852．612文献标志码：A文章编号：1671—4652(2014)03—0001一O5PreparationofE．colighostsandexpressionofpEGFP—N1mediatedbyE．colighostsinRAW264．7cellsJIAOHongmei，HELi，YANGHui，LIGuocai，CHENHongJU，YANHua，DAIHua，jlMingchun(CoilofMed，YangzhouUniv，Yangzhou

4、225001，China)ABSTRACT：ThebacteriophagePhiX174lysisgeneEwasamplifiedbyPCR，andclonedintotheplasmidpBV220tOcon—structrecombinanttemperature—controlledexpressionplasmidpBV220一E．TheplasmidpBV220EwassubsequentlytransformedintoE．colDH5a．TherecombinantbacteriaE．coli(pBV

5、220一E)wereculturedat42。Cforthegenerationofghosts．ThemouseRAW264．7cellsweretransfectedwiththebacterialghostsloadingpEGFP—N1，andexpressionofpEGFP—N1wasdetectedunderfluorescencemicroscope．TheresultsindicatedthatE．colghostswerepreparedSuccess—fully，theircontentswere

6、releasedtOextracellularregionandthe1ysisefficiencyofE．coli(pBV220一E)was99．ExpressionofpEGFP—N1mediatedbyE．colighostscanbedetectedintransfectedRAW264．7cells．Theseresultslayfoundationfordevelopingthenewinactivevaccineorvectorvaccinebasedonbacteriaghosts．KEYWORDS：E

7、．codighosts；bacteriophagePhiX174；lysisgeneE；temperature—controlledexpression；transfection细菌菌影(bacterialghosts)是利用噬菌体裂解基因E介导基因灭活的方法制得的细菌空壳。裂解基因E表达后，细菌细胞的内外膜融合并形成跨膜孔道，在渗透压的作用下，细菌细胞质内容物通过此跨膜孔道排出，形成一种空的“菌影”l1]。细菌菌影保留了活细菌外膜表面完整的形态和结构，易被机体免疫细胞识别捕获，可诱导机体产生体液免疫、细胞免疫及黏膜免

8、疫，且不具有活菌样的致病作用。细菌菌影内部可以装载DNA、药物等，故而可有效递送疫苗抗原和诱发相关免疫应答]。另外，细菌菌影具有天然的外膜结构、肽聚糖等佐剂效应的成分，因此还可以作为很好的佐剂]。本研究通过PCR扩增出噬菌体PhiX174的裂解基因E，将其与温控表达载体pBV220进行连接，构建出重组温控表达质粒pBV220一E，