暗纹东方纯CD8α基因克隆、原核表达与多克隆抗体制备.pdf

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1、第29卷第1期苏州科技学院学报(自然科学版)VoJ．29NO．12012年3月JournalofSuzhouUniversityofScienceandTechnology(NaturalScience)Mar．2012暗纹东方纯CD8c~基因克隆、原核表达与多克隆抗体制备邵爱华，杜建，陈葵，朱江(1．苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏苏州215123；2．苏州科技学院化学与生物512程学院，江苏苏州215009)摘要：CD8是与I型主要组织相容性复合体(MHCI)结合，是T细胞表面受体(TCR)的共受体，也是T淋巴细胞表面的重要标志物。该研究报道了暗纹东方纯胸腺等组织中

2、克隆获得CD8cDNA序列及其相应的基因组序列。克隆到的cDNA序列全长106lbp，包含1个657bp的开放读码框(ORF)，编码218个氨基酸；其对应的基因组序列为1533bp，包含5个内含子和6个外显子。生物信息学分析表明，D8蛋白质序列由信号肽、胞外可变区、铰链区、跨膜区和胞内区5部分组成。胞外区的可变区和铰链区部分各有两个高度保守的半胱氨酸残基，可能参与链内和链间二硫键的形成。氨基酸序列多重比对表明。暗纹东方鲍与其他鱼类的CD8a，特别是与鲽形目鱼类具有较高的同源性。为进一步研究暗纹东方纯CD8的生物学功能，构建了表达CD8ct成熟肽胞外区的重组质粒，诱导表达出重

3、组蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫大白兔，制备了抗血清。经间接ELISA法检测抗体效价表明，获得了高效价的特异性暗纹东方纯CD8a抗体，为进一步研究CD8在鱼类淋巴细胞进化和适应性免疫中的作用奠定了基础。关键词：CD8a；暗纹东方纯；鱼类免疫；原核表达；多抗制备中图分类号：Q959．489文献标识码：A文章编号：1672—0687(2012)01—0047-10T淋巴细胞是一类重要的免疫活性细胞，是适应性免疫应答中关键的效应细胞。在哺乳类等高等动物中已经鉴定出至少2种表面标记与表达谱式各不相同的主要亚群．即CD4和CD8q"细胞，后者为细胞毒性T细胞．是细胞免疫的主要效应细

4、胞，为MHCI类限制性_l-3]。CD8分子可能存在多种构型，天然的CD8分子由CD8o~和cD813两种亚基构成[4-6／。CD8ot是一个功能类似而且较为保守的跨膜蛋白，约由230个氨基酸构成，包含一个信号肽，一个Ig高变区，然后是富含脯氨酸的铰链区，之后是较为保守的跨膜区和胞质区。在哺乳类中．胞质区还包含一个保守的p56kk结合位点，但在硬骨鱼中缺乏此保守基序。在整个蛋白序列中半胱氨酸残基一直是人们研究的焦点。在哺乳类，CD8a可变区的两个半胱氨酸残基在各物种中是高度保守的，这两个残基在链内可以形成二硫键，另外两个保守的半胱氨酸残基在二聚体的形成中起重要作用【7-切。

5、与哺乳类动物相比，鱼类免疫反应的研究基础还十分薄弱。但随着基因组资料的积累，近年来在T细胞基因的克隆方面进展迅速[18。鱼类免疫系统所展现出的与高等动物不同的独特性质，不仅扩充了免疫学的研究范围，同时．对于养殖病害的免疫防治也具有重要的指导意义。虹鳟(Oncorhynchusmykiss)CD8ot分子作为第一个鱼类CD8分子被报道以来，已报道的CD8分子有斑马鱼(Daniorerio)、大西洋鲑(Salmosalar)、大西洋鲽鳙(Hippogl055~Shippoglossus)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、褐鳟(Sdmotrutta)、海鲷(S

6、paurala)、鲤(Cypri—ntt$carpio)、鲫鱼(CaF6lSSiusauratu~)、以及红鳍东方纯(Takifugurubripes)等[22-29]。暗纹东方纯(Tak／fuguciatus)俗称河豚，是具有极高经济价值的特种水产养殖对象，属硬骨鱼亚纲(Osteichthyes)、纯形目(TetrodontiforlTtes)、纯科(Tetraodontidae)、东方鲍属(Tak／fugu)，系北太平洋西部地区性分布的鱼类，与模式动物红鳍东方鲍同属，不少研究资料表明两者亲缘关系最为接近[3o-3。在暗纹东方鲍的放养过程中，由于集约化养殖的现状会导致鱼体

7、经常受到细菌、寄生虫以及病毒的侵染而导致免疫能力下【收稿日期】2011—09—16【基金项目】农业部行业标准资助项目(2002—04084)；苏州科技学院科研基金资助项目(2005一Z862)[作者简介】邵爱华(1968一)，女，江苏南通人，副教授，博士研究生，研究方向：水生动物分子生物学。通讯联系人：朱江(E—mail：sdzjyz@suda．edu．an)。48苏州科技学院学报(自然科学版)2012丘降。笔者克隆了暗纹东方纯的CD8ot分子的eDNA和基因组的序列，进一步对CD8oL成熟肽胞外区进行了原核表达和